【文章內(nèi)容簡介】 ，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。 無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。 這是標準配方: 裂解液：50mMTrisHCl(~),2mMEDTA,100mMNaCl,%TritonX100,1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用) 但我個人的經(jīng)驗是:如果你裂解細菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,溶液很粘. protocol是10ml50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體. 如果只做一個鑒定,我覺得100200ml菌就夠了. 但凡超聲,我都用60ml裂解液,因為我們的超聲儀(現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會冒泡泡,. 沉淀,也就是包涵體沉淀,如果要上柱純化,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上清,加入適量體積的表達重組蛋白時，細菌裂解方法都有哪些？ 在表達重組蛋白時，誘導(dǎo)以后跑SDSPAGE發(fā)現(xiàn)表達都很好，但是在裂解細胞時遇到問題?？偸遣荒軓氐琢呀饧毎?。 首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細菌沒有裂解。 我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復(fù)99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時再重復(fù)99次。菌體來自200ml培養(yǎng)液，用20mlPBS重懸。 然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100ug/ml，4C半小時菌液不變粘，加大濃度至1mg/ml，半小時后仍無明顯變化。，我懷疑是pH不合適，TEbuffer，1mg/ml溶菌酶，4C半小時仍無明顯變粘。因為這次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔(dān)心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒有明顯變化。 真是郁悶。到底出了什么事？請高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。 同時希望能介紹一下如何選擇細胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。 ？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應(yīng)如何保存？ 加入溶菌酶以后，如果細胞壁已破壞，菌液應(yīng)該變粘吧，因為核酸被釋放出來。 而超聲破碎細胞，我覺得菌液是不會變粘的，因為超聲可以把大分子核酸打碎成小片段。 我判斷細胞破碎不完全是因為，在將破碎后樣品離心分離上清和沉淀跑SDSPAGE觀察，發(fā)現(xiàn)在細胞碎片組分中除了經(jīng)常出現(xiàn)的一兩條帶以外，還有菌體總蛋白樣品中的很多帶出現(xiàn)。據(jù)此可以判斷細胞只是部分破碎。 不知我的分析是否正確，請版主和各位高手指教。 如果溶菌酶效果還可以，我覺得先用溶菌酶初步裂解細胞，然后再用超聲進一步破碎并斷裂大分子核酸以降低粘度的細胞破碎策略可能比較好。因為超聲有可能使蛋白變性，但單用溶菌酶不能確定是否完全破碎，還要再加核酸酶降低粘度。這種兩步法策略應(yīng)該還可以減少破碎條件優(yōu)化的時間。 我用的溶菌酶放置時間比較長了，有可能失活了。我剛從生工又定了一支，不過得后天到貨，但愿它有用。 如何觀察溶菌酶是否已裂解細胞，通過觀察粘度變化是否可以？ 只反復(fù)凍融是否可以有效裂解大腸桿菌細胞？ ，請務(wù)必保持PBS的pH＞，同時溶菌酶的量一定要足！ 在加入溶菌酶后，最好放于磁力攪拌器上攪拌30分鐘，再進行超聲破菌，我的超聲條件是：功率400W，工作2秒，間隔2秒，重復(fù)199次。菌體來自500ml培養(yǎng)物，用30mlPBS重懸，超聲效率還是可以的。 哪兒的溶菌酶好用？ 我用生工的溶菌酶，稱取干粉20mg。200ml菌液用18mlNaCl重懸，加入2ml25mMTrisHCl()，將溶菌酶干粉加入體系，混勻，測pH降低到5－6，加20ul2MTris堿，體系pH升到～8。4C放置1小時，菌液上層變澄清，搖動發(fā)現(xiàn)體系沒有變粘。測pH仍在8左右。再37C保溫1小時，還沒有變化，我簡直不知如何才好了。 另一瓶200ml培養(yǎng)物，溶菌酶處理1小時后超聲。條件：300W，超5秒停5秒，重復(fù)99次。菌液有變化，但很不明顯。繼續(xù)超聲400次，從外觀來看沒有太大區(qū)別。我簡直要說tmd了。見鬼了。 我的操作有什么地方不妥當(dāng)，請各位指正。 溶菌酶的廠商要求是否很重要？ 我的誘導(dǎo)物來自1：20過夜培養(yǎng)物接種，37C生長3小時后30C誘導(dǎo)2小時（IPTG）。 是否菌液太濃，Pharmacia的說明書200ml培養(yǎng)物用10ml重懸，我用20ml，仍然不夠稀？有人告訴我菌液應(yīng)該稀一些，200ml用30－40ml重懸。但實際操作也不夠理想。 SDSPAGE總是觀察到細胞破碎效果不夠徹底。超聲那么多次，蛋白都要被超碎變性了。 酵母的破碎 酵母是一類單細胞真菌的總稱，其成員分別屬于不同的真菌綱，細胞壁成分是否會有較大差別，這些都是做破碎酵母細胞前要考慮的。我歸納了一下，做破碎酵母的幾種方法： 1機械的方法：一般的PROTOCOL都是用glassbeads：如sigmaG8772，加玻璃珠后超聲，蛋白活性保持較好。 2化學(xué)裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀（希望高手點評） 3尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,）高壓勻漿。（這個好象也該在方法2中） 4液氮凍融并研磨酵母破壁，我認為這種可能在小試中比較合適。 5溫和的酶法，可能不會會破壞酵母原生質(zhì)體 酶法裂解主要用兩種酶：1。蝸牛酶，可以直接從蝸牛的胃液中獲得；2。lyticase，可以從sigma定購。這兩種酶解法都可以和上面的幾種方法結(jié)合使用，尤其是glassbeads方法，效果很好。 我用過化學(xué)裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的，不妨試一下。 一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,），據(jù)說效果可以 酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠，就象microbe和rongjunli所說的那樣，效率很高的，而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應(yīng)該用這個方法。 超聲破碎的條件選擇 超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實驗要求，有的是細菌破碎，有的是對組織細胞進行破碎，要掌握好功率和每次超聲時間，功率大時，每次超聲時間可縮短，不能讓溫度升高，必要時在冰浴條件下進行超聲破碎。至于每次超聲時是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問題，這與你超聲的量明顯有關(guān)。 如何鑒定細菌超聲破碎的程度 最簡單的方法： 切記：只用結(jié)晶紫染色，別忘了染色后再用水稍沖洗一下 細菌裂解的DNaseI 不同純度的酶換算標準不同，所以你最好查查是哪個公司的酶？仔細看說明書，可能會有換算說明。 另外看一下參考文獻所用的酶是哪個公司的，到該公司的主頁也可能有收獲。 我用過華美和TAKARA的DNA酶，華美的是用mg/ml。華美也有RNasefree的DNA酶，定量用活性單位。TAKARA的兩種酶都是用活性單位定量的。 我在超聲裂解細菌時加入一些DNA酶，一般用超聲液加不同量的酶做一個預(yù)實驗，選取符合你需要的酶量。 其實根據(jù)目的和方法的不同，所需要的酶量也是可調(diào)節(jié)的，比如酶切溫度（16度或37度）。 超聲裂解細菌是否完全？ 最簡單的方法： 切記：只用結(jié)晶紫染色 二、包涵體的洗滌 包涵體的洗滌問題 通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好。 包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對比，因為有時候難溶解的就是你的目標蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對比，免得把目標蛋白弄丟了。 此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長點時間，也需要大量的溶劑。如果說是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。 如何得到比較純的包涵體 對于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。 包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細菌成分,如一些外膜蛋白、質(zhì)粒ＤＮＡ和其它雜質(zhì)。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和還原劑2巰基蘇糖醇（DTT）、β巰基乙醇等反復(fù)多次進行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強度升高而加強，在洗滌包涵體時可加50mMNaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達50%以上，而且可保持元結(jié)構(gòu)。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理條件相近為宜。mM。去垢劑如TritonX100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質(zhì),這一步很重要,因為大腸桿菌外膜蛋白OmpT(37KDa)在48mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復(fù)性過程中可導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解。 對于尿素和鹽酸胍的選擇： 尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素810M，鹽酸胍68M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為7090%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。 鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點。 包涵體最后的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析尤其是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯，通常是一步就能達到純度為95%以上的包涵體。 8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過夜后出現(xiàn)沉淀，這種現(xiàn)象我也在實驗中遇到過。開始感覺很奇怪，后來發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問題實驗際溫度要比設(shè)定溫度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不過我接著往下進行SDSPAGE、層析等發(fā)現(xiàn)沒有什么不良影響。所以，你不用擔(dān)心也許你的蛋白也只是和你開了個玩笑呢！ 三、關(guān)于包涵體的溶解： 請教GST包涵體溶解 直接用8M的脲或6M胍融解，取上清，測濃度。直接稀釋后包被檢測相應(yīng)抗體。（由于快速稀釋相當(dāng)于復(fù)性過程，產(chǎn)物用于檢測沒有問題的） 我所用的包涵體提取方法： 1．PBS或生理鹽水洗滌誘導(dǎo)后菌體，BufferA重懸菌體，超聲波破碎至清亮 ２．４度，１００００rpm離心１０分鐘，棄上清 ３．用ＰＢＳ或生理鹽水洗滌沉淀２－３次 ４．往沉淀中加１９．７mlBufferA及０．３ml?。玻埃サ模樱耍蹋ㄊ榛“彼徕c）貯存液，劇烈攪動，使其緩慢溶解，室溫靜置３０分鐘至２小時 ５．４度，１００００rpm離心１０分鐘，取上清 ６．加２０％ＰＥＧ４０００?。玻保皍l至終濃度為０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至終濃度為１mM,加100mM的還原型谷胱甘肽４２０ul至終濃度為２mM,靜置３０分鐘至２小時（亦可４度復(fù)性過夜） ７以ＰＢＳ（)或ＴＥ（)透析，取出－２０度保存?zhèn)溆?！BufferA配方： 　　　Trisbase50mM EDTA NaCl50mM 甘油　　5% DTT5mM 包涵體的溶解 十二烷基肌氨酸鈉與十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時，可不可以互相代替？可以替換，調(diào)pH不久沒什么區(qū)別了嗎；兩者的功能團相同，pH不同，前者鈉鹽便于保存罷了 有關(guān)包涵體的溶解問題 強的變性劑如尿素（68M）、鹽酸胍（GdnHCl6M），是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性pH值下長期保溫時。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。 8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存? 我在4度放了半個月，目前沒出什么問題 8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問題? BI溶液在室溫放置48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸?；?，因而早些處理BI溶液比較好。具體有什么影響我也不是很清楚。 GST融合蛋白形成包含體不溶，咋辦？ GST融合蛋白應(yīng)該不能用尿素等作用太強的變性劑，