【正文】 過(guò)高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，過(guò)多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。 重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。 重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。 包涵體表達(dá)的有利因素： 可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解。 降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高。 包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡(jiǎn)單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。 對(duì)機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細(xì)胞膜碎片分離。 破菌： 機(jī)械破碎 超聲破碎 化學(xué)方法破碎 分離： 離心：500020000g15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。 過(guò)濾或萃取方法： 洗滌： 由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM,1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。 溶解： 常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GdnHCl68M），通過(guò)離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，異氰硫酸胍（GdnSCN）最強(qiáng)。 去垢劑：如強(qiáng)的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問(wèn)題是由于SDS無(wú)法徹底的去除而不允許在制藥過(guò)程中使用。 極端pH：可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。如有人在pH。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。 變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，一般不要超過(guò)pH10。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL4。增溶時(shí)一般室溫過(guò)夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。 還原劑： 由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50100mM2BME或DTT，也有文獻(xiàn)使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無(wú)關(guān)，而有些沒(méi)有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無(wú)影響，如牛生長(zhǎng)激素包涵體的增溶。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。 復(fù)性： 通過(guò)緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開(kāi)始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，時(shí)復(fù)性過(guò)程已經(jīng)結(jié)束。 復(fù)性中常采用的方法有： 稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過(guò)夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。 透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無(wú)法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。 超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過(guò)程中不可逆的變性。 柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，如華北制藥的GCSF復(fù)性據(jù)說(shuō)是通過(guò)柱上復(fù)性進(jìn)行的。常用于復(fù)性的層析方法有SEC、HIC等。 還原劑的去除： 還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由于二硫鍵的形成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之后，在去除還原劑使已經(jīng)按照正確的結(jié)構(gòu)相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。 常用的氧化方法有： 空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價(jià)銅離子，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢(shì)。 氧化還原電對(duì)（redox）：常采用GSSG/GSH，通過(guò)調(diào)整兩者的比例來(lái)控制較精確的氧化還原電勢(shì)，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mMDTT=GSH/GSSG()。 復(fù)性的效率： 復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。 復(fù)性過(guò)程的添加劑： 共溶劑：如PEG600020000，據(jù)說(shuō)可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團(tuán)，此外由于阻止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機(jī)會(huì)，也可能對(duì)復(fù)性效率的提高起作用。%左右，具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件確定。 二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和脯氨酸異構(gòu)酶（PPI）：PDI可以使錯(cuò)配的二硫鍵打開(kāi)并重新組合，從而有利于恢復(fù)到正常的結(jié)構(gòu)，此外在復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變需要較高能量，常常是復(fù)性過(guò)程中的限速步驟，而PPI的作用是促進(jìn)兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)復(fù)性的進(jìn)行。 分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒(méi)有蛋白質(zhì)特異性的促進(jìn)折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時(shí)無(wú)法自己正確的折疊。有人構(gòu)建了與伴侶分子共同表達(dá)的菌株，據(jù)說(shuō)效果不錯(cuò)。不過(guò)在生產(chǎn)中還沒(méi)有看到2和3的應(yīng)用的例子。 ：成功的應(yīng)用于很多蛋白如tPA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。 甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機(jī)會(huì)，一般使用濃度在%530%。 一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團(tuán)間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊。 輔助因子：添加蛋白質(zhì)活性狀態(tài)必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時(shí)候?qū)Φ鞍踪|(zhì)正確的折疊是有利的。 色譜法：通過(guò)將目標(biāo)蛋白結(jié)合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來(lái)越多的應(yīng)用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。 當(dāng)然，雖然有很多所謂的理性的復(fù)性方案設(shè)計(jì)，目前的復(fù)性工作更多的是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)的過(guò)程，沒(méi)有一種通用的方法可以套用。 復(fù)性時(shí)的蛋白濃度： ，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟(jì)，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩(wěn)定，很容易變性。 復(fù)性效果的檢測(cè)： 根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。 凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。 光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過(guò)程檢測(cè)。 色譜方法：如IEX、RPHPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。 生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。 黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見(jiàn)的沉淀析出。 免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。 幾個(gè)復(fù)性的實(shí)例： MHCIIJBC269（47）：1994 增溶：1640mgProtein,8MGdnHCl,1632mMDTT,1mMEDTA,50mMTris. 復(fù)性：816folddilutionto15mg/mlProtein. 增溶：10mMDTT,%SDS,25mMTris,200mMGlucine. 復(fù)性：10倍稀釋到10mMDTT,2mMDodOMalt(dodecylbetaDmaltoside),150mMNaCl,10mMTris，開(kāi)口透析8hr，對(duì)150mMNaCl,10mMTris BovinePrethrombin2,JBC270(1):1990四對(duì)二硫鍵。 增溶：7MGdnHCl,10mMTris,1mMEDTA4mg/ml. 復(fù)性：稀釋到100mMNa2HPO4,2mMEDTA,%PEG,04MGdnHCl,mMGSSG,mMGSH,mg/ml25mMsodiumphosphate,2mMEDTA,%PEG,透析3次，溫度4度。 純化： 一般說(shuō)來(lái)，復(fù)性液的體積較大，為了減少處理體積，在進(jìn)行柱純化以前可以先進(jìn)行硫酸銨沉淀，沉淀在低速離心收集后復(fù)溶的鹽濃度較高，可以直接進(jìn)行HIC純化，目標(biāo)峰經(jīng)適當(dāng)稀釋后（cond5mS/cm）進(jìn)行IEX純化，然后通過(guò)SEC脫鹽，更換緩沖液，除菌過(guò)濾后，在質(zhì)量合格的情況下便可以進(jìn)入制劑階段。 當(dāng)然在復(fù)性濃度較高的情況下，也可以直接將復(fù)性液進(jìn)行IEX純化，優(yōu)點(diǎn)是在純化的同時(shí)進(jìn)行體積的濃縮，為以后的精制創(chuàng)造條件。 從生產(chǎn)的角度看，由于每增加一步純化工序便降低很多收率，所以可過(guò)兩到三次柱純化，工藝越簡(jiǎn)單越有利于收率的提高。當(dāng)然這只是一個(gè)一般的原則，對(duì)于純度要求較高的產(chǎn)品如重組人白蛋白，不得不進(jìn)行多次純化。包涵體蛋白的純化和復(fù)性包涵體蛋白的純化和復(fù)性1．菌體的收集和破碎用50 ml離心管分別收集誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)物，8000 rpm 4℃離心10 min。沉淀用適量的超聲破菌緩沖液重懸。【備注】超聲破菌緩沖液（20 mmol/L TrisHCl 、 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重懸后的菌液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，其條件為：功率為300W，占空比50%，每個(gè)循環(huán)30 s，總時(shí)間20 min。破碎后的勻漿， 4℃、 12000 rpm離心15 min。分別取上清液和沉淀進(jìn)行12% SDSPAGE分析，確定目的蛋白是否以包涵體的形式表達(dá)。2．包涵體的處理洗滌：沉淀用適量的包涵體洗滌緩沖液重懸后，攪拌洗滌20~30 min，于4℃，12000 rpm離心15 min，棄去上清液。重復(fù)一次。再用適量的50 mmol/L Tris （以去除殘留的EDTA），于4℃ 12000 rpm離心15 min，棄去上清液。【備注】包涵體洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris－HCl pH ， mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X100溶液：量取2mlTriton X100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M緩沖液98ml即可。溶解：沉淀用適量的包涵體溶解緩沖液重懸，室溫?cái)嚢?6小時(shí)或過(guò)夜。12000 rpm 4℃離心15 min，收集上清液?！緜渥ⅰ堪w溶解緩沖液（20 mmol/L Tris－HCl pH ， mol/L NaCl，8 mol/L尿素， mmol/L DTT或100 mmol/L β巰基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的純化 親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。 另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽,組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性或弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫。組氨酸標(biāo)簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)：首先，由于只有6個(gè)組氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能夠保持結(jié)合力；另外6組氨酸標(biāo)簽無(wú)免疫原性，重組蛋白可直接用來(lái)注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標(biāo)簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯(cuò)誤折疊等。鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì)通過(guò)氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會(huì)非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。融合蛋白的表達(dá)和純化過(guò)程： ml 2YT或LB 培養(yǎng)中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。：100的比例取過(guò)夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接。37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD ?！?mM/L。 37℃搖床培養(yǎng)4～6h。，去上清。按40ml/100ml菌液加入1Binding Buffer {破碎緩沖液組成： 50mM Tris ～,1mM EDTA ，溶菌酶(10 礸/g cell)，；或 20 mmol/l TrisHCl, pH ,1mmol/lEDTA, PMSF, DNAse (10 礸/g cell) }細(xì)胞破碎緩沖液中不含脲等變性劑，故不溶解包涵體?；?PBS重懸細(xì)胞。：占空比50％，超聲15s，停15s，10～20min。破碎后的勻漿在4℃，12,000 rpm下離心30 min，棄去上清液。：2M尿素在50mM Tris ～,1mM EDTA ，10% Triton X100中洗滌。洗滌2～4h 去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris ,1mM EDTA ，10% TritonX100，二硫鍵還原劑中洗滌。洗滌4～8h，使包涵體變性可溶。7. 過(guò)Ni柱：Ni2＋親和層析柱純化 包涵體溶解后的上清液，用鎳親和層析柱純化。操作過(guò)程參照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南進(jìn)行。具體過(guò)程如下：轉(zhuǎn)移樹(shù)脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗滌鎳親和層析柱，以除盡基質(zhì)中的乙醇和空氣，并防止下一步Ni2＋沉淀；5柱體積的Charge Buffer充電；20柱體積的三蒸水洗滌，去盡游離的Ni2＋；10柱體積的Binding Buffer平衡柱子；手工上樣，根據(jù)蛋白的濃度來(lái)確定上樣體