【文章內(nèi)容簡介】 11116111111111111117111111111111118111111111111119111111111111111011111111111111111111111111111112111111111111111311111111111111141111111111111115111111111111111611111111111111注：Y**表示GSH產(chǎn)量，單位為mg/L。 PlackettBurman 設(shè)計試驗的的回歸系數(shù)及其顯著性檢驗Tab Regression coefficients and their significance test of PlackettBurman design EffectEstimateStd Errort RatioP ValueX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14利用SAS軟件對PlackettBurman試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，Pr F值( P值)的大小表明模型及各個考察因素的顯著水平。Pr ，Pr 。其中X1，X6，X10是有意義的模型參數(shù)，因為Pr 。所以對應(yīng)的因素葡萄糖，酵母膏和(NH4)2SO4對GSH的產(chǎn)量具有顯著性的影響，而其它的因素顯著性較小。 BoxBehnken設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基試驗結(jié)果以主要影響GSH產(chǎn)量的葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4的濃度(g/L)為自變量。 BoxBehnken試驗因素與水平 The factors and levels of variables used in BoxBehnken design試驗因素代碼編碼水平/(g/L)10+1葡萄糖X1102030酵母膏X251015(NH4) 2SO4X34810 BoxBehnken試驗設(shè)計和試驗結(jié)果 Experimental design and results of BoxBehnken 試驗編號X1X2X3Y**111021103110411050116011701180119101101011110112101130001400015000采用國際權(quán)威的SAS軟件回歸擬合表試驗數(shù)據(jù)，可以得到二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ蜑閅=+X1+X1X1X2X3X3式中，Y代表GSH產(chǎn)量，XXX3分別代表培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4的濃度(g/L)。通過SAS軟件進(jìn)行方差分析來驗證回歸模型及各參數(shù)的顯著度，模型Pr ，表明該模型是高度顯著的。經(jīng)F檢驗，模型中的參數(shù)X1，X2，X1X1，X2X2，X3X3 都是顯著的(Pr )。同時，%，大于90%，% ，能對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行較好的擬和，說明模型相關(guān)度很好。變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度，CV 值越低模型的置信度越高,%，說明模型方程能夠很好地反映真實的試驗值。 回歸方程的方差分析 Variance analysis of the regression equation方差來源自由度平方和均方F值Pr FX11X21X31X1X11X1X21X1X31X2X21X2X31X3X31Model9一次項3二次項3交叉項3殘差項5失擬項3誤差2和14Rsquare%%RMSE%CV%在保持1個因素為零水平下，直觀地反應(yīng)了各因素對響應(yīng)值的影響關(guān)系。在最優(yōu)條件下：葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4分別為20g/L、10 g/L、8 g/L 時，預(yù)測GSH 。為驗證模型準(zhǔn)確性和有效性，在預(yù)測最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(重復(fù)3次)，、?？梢娫撃Ｐ湍茌^好預(yù)測發(fā)酵所產(chǎn)GSH產(chǎn)量。因此，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 ，水1000mL。 Fixed levels：X1=0 Fixed levels：X2=0 Fixed levels：X3=0 GSH產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖 Response surface analysis of GSH yield 結(jié)論PlackettBurman設(shè)計法是一種經(jīng)濟(jì)且有效的試驗設(shè)計方法，它能快速、有效地從眾多因子中篩選出能促進(jìn)啤酒酵母Y14高產(chǎn)GSH的因子；響應(yīng)面法(RSM) 能快速對主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化與評價，并能得到各因素最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。通過PlackettBurman試驗篩選出葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4是影響啤酒酵母Y14高產(chǎn)GSH的關(guān)鍵因子，進(jìn)而用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,得到的最適培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 。對優(yōu)化配方進(jìn)行驗證試驗。第3章 啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH發(fā)酵條件的優(yōu)化為了使菌株進(jìn)一步提高GSH的合成能力，僅確定最佳培養(yǎng)基成分是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還必須對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為最終的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實驗依據(jù)。影響發(fā)酵產(chǎn)量的環(huán)境參數(shù)主要有溫度、pH、溶解氧等。溫度對菌體生長、酶活性都有直接的影響。pH影響細(xì)胞對營養(yǎng)成分的吸收及代謝途徑，從而影響細(xì)胞生長及GSH積累。GSH發(fā)酵過程中氧的供應(yīng)是個關(guān)鍵因素，溶氧濃度是微生物生長和GSH形成率的重要參數(shù)之一。國內(nèi)對面包酵母和重組大腸桿菌發(fā)酵過程中的溫度、pH值、搖瓶裝液量等環(huán)境條件的影響已有較多研究，但GSH的產(chǎn)量均值仍不理想。另據(jù)研究表明，添加L谷氨酸、L半胱氨酸和甘氨酸等三種前體氨基酸及其混合物能提高細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，其中以L半胱氨酸的效果更為顯著。Miyamoto等[52]，向培養(yǎng)基中添加L半胱氨酸可以使胞內(nèi)GSH含量大幅度提高，Watanabe等[53]發(fā)現(xiàn)。Alfafara[54]，結(jié)果表明，一次性補加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生產(chǎn)速率。本章在前一章發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選試驗的基礎(chǔ)上，利用單因素試驗分別研究了啤酒酵母Y14發(fā)酵最適溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量及添加前體氨基酸和ATP對GSH產(chǎn)量的影響，并確定其最優(yōu)發(fā)酵條件。 材料 菌種：啤酒酵母Y14，由XXXX大學(xué)工業(yè)微生物湖北省重點實驗室再生資源微生物轉(zhuǎn)化研究室提供。 培養(yǎng)基： 斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5，瓊脂20。 種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5。 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖 20，酵母膏10，(NH4)2SO4 8，KH2PO4 3，MgSO4 ，水1000mL。 補料培養(yǎng)基L谷氨酸10mmol/L，甘氨酸 6mmol/L，L半胱氨酸 10mmol/L，ATP 。 主要試劑L谷氨酸BR中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司L半胱氨酸AR武漢市華順生物技術(shù)有限公司甘氨酸BR中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司ATPBR上海源聚生物科技有限公司 主要儀器同第2章。 方法 啤酒酵母Y14生長曲線的測定采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，利用分光光度計在波長560nm波長下，每隔2小時測定一次菌懸液的OD值，以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制其生長曲線。 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗啤酒酵母Y14連續(xù)培養(yǎng)12小時，后每隔8小時取樣測量生物量及GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗在其他發(fā)酵條件不變時，考察了當(dāng)溫度分別為25℃、28℃、30℃、32℃、35℃時，發(fā)酵60h時，啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗在其他發(fā)酵條件不變時，、7時，啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗在其他發(fā)酵條件不變時，考察了當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速分別為120rpm、150rpm、180rpm、210rpm、240rpm時，啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗在其他發(fā)酵條件不變時，考察了當(dāng)搖瓶裝液量分別為30mL/300mL、50mL/300mL、70mL/300mL、90mL/300mL、110mL/300mL時，Y14酵母菌產(chǎn)GSH所得到的細(xì)胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH的進(jìn)程試驗 在搖瓶培養(yǎng)20h時，向搖瓶中加入補料培養(yǎng)基：L谷氨酸 10mmol/L，甘氨酸 6mmol/L，L半胱氨酸 10mmol/L，ATP [55]。觀察整個發(fā)酵過程的各項指標(biāo)變化。 結(jié)果與分析 啤酒酵母Y14生長曲線的繪制，啤酒酵母Y14在6h開始進(jìn)入生長對數(shù)期，6～14h為對數(shù)生長期，14h開始進(jìn)入穩(wěn)定期。 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗結(jié)果，GSH產(chǎn)量的最大值出現(xiàn)在60h，60h后GSH產(chǎn)量開始出現(xiàn)下降趨勢；而生物量在52h達(dá)到最大，52h后趨于穩(wěn)定；GSH含量在60h達(dá)到最大，60h后變化甚微。綜合考慮，選擇GSH產(chǎn)量最高的時刻60h作為Y14菌株的發(fā)酵周期。此時，。 發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗結(jié)果溫度是影響微生物生長繁殖的最重要因素之一。一般而言，隨著溫度的增加，生長速率也會增加，但機體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸等對溫度都比較敏感，如果溫度上升到一定程度將會對機體產(chǎn)生不利影響，此外，過高或過低的溫度都會使細(xì)胞膜的正常功能喪失，因此，應(yīng)選擇最適的培養(yǎng)溫度。，培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)GSH的影響比較顯著，隨著培養(yǎng)溫度升高，GSH產(chǎn)量有明顯提高，在30℃時，發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量最大，此后，隨著培養(yǎng)溫度的升高，GSH產(chǎn)量反而下降，這可能是因為在高溫條件下不利于易被氧化分解的GSH的積累，因此應(yīng)選擇30℃為最適發(fā)酵溫度。 發(fā)酵初始pH值的優(yōu)選試驗結(jié)果發(fā)酵液的pH除了對細(xì)胞發(fā)生直接影響之外，如影響細(xì)胞的通透性，還對細(xì)胞產(chǎn)生不同的間接影響，例如，影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性，以及影響代謝反應(yīng)中各種酶的活性等，因此，發(fā)酵液的pH也是影響微生物生長繁殖的最重要因素之一。，GSH的產(chǎn)量最高。 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗結(jié)果氧是構(gòu)成細(xì)胞本身及其代謝產(chǎn)物的成分之一，雖然培養(yǎng)基中大量存在的水及其他成分可以提供氧元素，但許多微生物細(xì)胞必須利用分子態(tài)的氧作為呼吸鏈電子系統(tǒng)末端的電子受體，在電子傳遞過程中釋放出大量能量供細(xì)胞維持生長和代謝作用，氧是一種難溶氣體，在室溫和常壓條件下，純氧的溶解度僅為36mg/L，空氣中氧的溶解度僅為8mg/L，當(dāng)水中溶有糖和其它物質(zhì)時，氧的溶解度更低，啤酒酵母Y14的發(fā)酵過程是好氧發(fā)酵過程，因此，在它發(fā)酵時必須不斷的向培養(yǎng)液供給足夠的氧以滿足其生長代謝的需要，但過大的溶氧又會抑制菌體的生長代謝，因此，適宜的溶氧能提高代謝產(chǎn)物的濃度，而在實驗室搖瓶發(fā)酵過程中溶氧濃度是通過搖床轉(zhuǎn)速控制的。，搖床轉(zhuǎn)速對菌體產(chǎn)GSH的影響幅度較大，在搖床轉(zhuǎn)速為180rpm時，發(fā)酵液中GSH的產(chǎn)量最高，因此選用180rpm為以后試驗的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗結(jié)果 改變搖瓶裝液量會影響發(fā)酵液的溶氧濃度，從而影響菌體對GSH的積累。，最佳搖瓶裝液量為30mL/300 mL。 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH進(jìn)程曲線的繪制GSH在生物體內(nèi)是由γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH Ⅱ)在ATP存在的條件下，催化L谷氨酸、L半胱氨酸和甘氨酸進(jìn)行序貫反應(yīng)而形成的[56]。通常情況下在GSH發(fā)酵生產(chǎn)過程中，所需的三種前體氨基酸可以通過