【文章內容簡介】 的液體粹取蒸發(fā)完，得到淡黃色透明液體，即胱胺。本實驗利用化學沉淀法制備Fe3O4納米粒子，并通過透射電鏡、MRI響應、傅里葉紅外光譜分析對制備的Fe3O4納米粒子的特性進行表征；通過MRI響應、傅里葉紅外光譜分析對制備的PEGGd2O3納米粒子的特性進行表征；通過傅里葉紅外光譜分析對制備的胱胺進行表征。實驗數據表明Fe3O4納米粒子、PEGGd2O3納米粒子以及“連接物”胱胺制備成功，可以用于后續(xù)實驗。3 可激活MRI納米探針Fe3O4SSGd2O3的制備為了確定可激活對比劑中四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子和氧化釓（PEGGd2O3）的最佳濃度，需要四氧化三鐵和氧化釓的濃度進行優(yōu)化處理。用控制單一變量的方法，首先確定一個氧化釓的量，通過改變四氧化三鐵的濃度，配制溶液進行MRI掃描，得到四氧化三鐵的最佳濃度；然后再同理按照上述方法，確定最佳氧化釓和谷胱甘肽的濃度。 Fe3O4SSGd2O3的傅里葉變換紅外光譜分析為了驗證Fe3O4表面及PEGGd2O3表面的羧基與胱胺上的氨基共價結合成Fe3O4SSGd2O3納米探針，我們將稀釋的Fe3O4COOH、PEGGd2OGd2O3cystamine和Gd2O3SS Fe3O4納米探針進行傅里葉變換紅外光譜分析。紅外光譜分析的結果用Origin作圖。 納米探針組裝的紅外光譜圖，出現游離的氨基，在33003500cm1之間出現雙峰，同時羧基中的C=O向低頻移動，為酰氨鍵中的C=O，與Fe3O4COOH進一步結合后，游離的NH2消失，說明與Fe3O4上的羧基發(fā)生縮合反應。說明Fe3O4SSGd2O3納米探針共價組裝的成功制備。（Fe3O4）納米粒子對MRI信號的影響首先準備PEGGd2O3SSNH2：取一定量的PEGGd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N羥基琥珀酰亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時。，編號為1—5，在其中都加入500μL的PEGGd2O3SSNH2；（）、100μL（其中含Fe3O4 ）、150μL（其中含Fe3O4 ）、200μL（其中含Fe3O4 ）、250μL（其中含Fe3O4 ）；、110μL、配成總量一定的5個溶液。用高速冷凍離心機在10000轉每分的條件離心10min，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成5個Fe3O4濃度不同的Fe3O4SSGd2O3溶液。為了便于對比分析，每個樣品分別配2管掃MRI，其中一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（10mM GSH）。制成共10個樣品掃MRI。 不同濃度Fe3O4下GSH的MRI信號響應，當有谷胱甘肽存在時，磁共振信號比沒有谷胱甘肽時的磁共振信號亮度明顯增強，圖像的信噪比最大。所以，，圖像信噪比最大，圖像質量最高。（PEGGd2O3）對MRI信號的影響首先也是準備PEGGd2O3SSNH2：取一定量的PEGGd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N羥基琥珀酰亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時。由于本實驗中Fe3O4的量固定不變，所以EDC和NHS的量都不需改變。，四氧化三鐵的最佳濃度為：，所以在討論氧化釓的最佳濃度時，四氧化三鐵的濃度取最佳濃度。，選擇氧化釓量為500μL，因此本實驗中設置的氧化釓的濃度改變時必須包括500μL。，編號為1—7，；然后分別在7個EP管中加入制備好的PEGGd2O3SSNH2100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、800μL；再用移液器分別在5個EP管中加入蒸餾水700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、0μL，配成總量一定的7個溶液。用高速冷凍離心機在10000轉每分的條件離心10min，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成7個PEGGd2O3濃度不同的Fe3O4SSGd2O3溶液。為了便于對比分析，每個樣品分別配2管掃MRI，其中一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（10mM GSH）。制成共14個樣品掃MRI。 不同濃度PEGGd2O3下GSH的MRI信號響應，當有谷胱甘肽存在時，磁共振信號比沒有谷胱甘肽時的磁共振信號明顯變明亮許多，當PEGGd2O3為500μL時，圖像信噪比最大。所以認為PEGGd2O3的最佳濃度為500μL，當PEGGd2O3濃度為500μL時，圖像信噪比最大，圖像質量最高。（GSH）對T1弛豫率的影響，分別編號為a1a7（沒有谷胱甘肽）、p1p7（有谷胱甘肽），在a1a7中分別加入250μL Fe3O4SSGd2O10μL蒸餾水，200μL Fe3O4SSGd2O60μL蒸餾水，150μL Fe3O4SSGd2O110μL蒸餾水，100μL Fe3O4SSGd2O160μL蒸餾水，50μL Fe3O4SSGd2O210μL蒸餾水，25μL Fe3O4SSGd2O235μL蒸餾水，260蒸餾水。p1p7中Fe3O4SSGd2O3分別與a1a7相同。 GSH對不同濃度PEGGd2O3的MR信號T1弛豫率影響，當有谷胱甘肽存在時，不同濃度氧化釓的MR信號T1弛豫時間的回歸方程為：y=+，即有谷胱甘肽存在時。然而，當沒有谷胱甘肽時，不同濃度氧化釓的MR信號T1弛豫時間的回歸方程為：y=+，即沒有谷胱甘肽存在時。也就是說，有谷胱甘肽存在時的弛豫率是沒有谷胱甘肽時的近3倍，說明所制備的納米探針對谷胱甘肽有靈敏的MR響應，有望用于腫瘤細胞內GSH的MRI。（GSH）的MRI信號響應同理制備Fe3O4SSGd2O33mL，編號為112，在12個EP管中都加入150μL Fe3O4SSGd2O3，112號EP管中分別加入110μL蒸餾水,109μL 蒸餾水、 GSH、 蒸餾水，1μL GSH， GSH、108μL蒸餾水， GSH、107μL蒸餾水， GSH、106μL蒸餾水， GSH、105μL蒸餾水， GSH、104μL蒸餾水， GSH、103μL蒸餾水， GSH、102μL蒸餾水， GSH、101μL蒸餾水， GSH、100μL蒸餾水制成總量為260μL的12個樣品。 不同濃度GSH的MRI T1弛豫率由于腫瘤組織中GSH含量遠遠高于正常組織，當GSH濃度大于等于4mmol/L時，T1弛豫時間改變明顯，文獻記載腫瘤組織的GSH含量大于5mmol。因此可激活納米探針可以把腫瘤組織和正常組織區(qū)分開。達到特異性診斷腫瘤的目的。 討論本章節(jié)首先通過控制單一變量的方法對制備的可激活磁共振對比劑Fe3O4SSGd2O3納米探針的濃度進行優(yōu)化，PEGGd2O3的最佳濃度為500μL；然后通過比較有無谷胱甘肽存在時材料的MRI 掃描T1弛豫率，數據表明當有谷胱甘肽存在時，T1弛豫率明顯提高，對比效果更佳，且當GSH濃度超過3mol/L時，弛豫率明顯改變，而腫瘤組織中GSH高表達，從而可以實現對腫瘤組織的特異性診斷；最后通過傅里葉紅外光譜分析對材料進行表征并比較，證明可激活磁共振對比劑Fe3O4SSGd2O3納米探針制備成功。4 可激活MRI納米探針Fe3O4SSGd2O3的MTT測試隨著免疫學、血液學和腫瘤學研究的不斷深入和發(fā)展，科研部門和臨床醫(yī)院檢測各種細胞和細胞因子活性等方面的工作日益增多，但是其檢測方法多不盡人意。細胞毒性檢測的方法有很多種，如MTT 法，CCK8 法，LDH 法等。這些方法雖各具優(yōu)點，但都存在局限性。自從1983年美國學者Mosmamn建立了MTT比色法以來，以其快速、靈敏、簡便、準確等優(yōu)點受到人們的普遍重視，現已廣泛應用于各個領域，例如檢測細胞對化學藥物的敏感性，刺激劑對免疫細胞的反應、免疫細胞毒性、細胞因子活性等[41]。因此本文選用MTT法進行細胞毒性實驗。MTT產品為淡黃色粉末，易被水溶解和透過細胞膜進入細胞內，可被活細胞內的琥珀酸脫氫酶還原，形成不溶于水的藍紫色甲躦（Formazam）結晶。該結晶可溶于酸性異丙醇、二甲亞砜、SDS等有機溶劑中，再通過酶標儀依顏色深淺測定出各吸光度值。由于結晶物形成的量與細胞數量及代謝活性成比例，因此吸光度值的大小可反應細胞的數量及活性。為了將制備得到的Fe3O4SSGd2O3可激活對比劑用于腫瘤細胞的MRI診斷，首先利用MTT測試考察了該納米探針的生物相容性。 實驗試劑及器材（1）所用試劑：乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），（美國Sigma公司）；N羥基琥珀酰亞胺（NHS），（美國Sigma公司）；改良型RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone，賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司）；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司）；磷酸鹽緩沖液(PBS，自配)；MTT粉末；胰酶（美國Giboc公司）；二甲基亞砜(DMSO，美國PIERCE公司）。（1）所用器材：80℃冰箱，(日本SANYO公司)；4℃冰箱，（中國海爾集團）；20℃冰箱，（中國海爾集團）；培養(yǎng)板，（美國Corning公司）；培養(yǎng)瓶，（美國Corning公司）；15 mL及50 mL離心管，（美國Corning公司）；EP管，（美國AXYGEN公司）；漩渦混合器(XHC)，（金壇市白塔新寶儀器廠）；20 mL、100 mL、1000 mL微量移液器，（德國Eppendorf公司）；移液器槍頭，（美國AXYGEN公司）；醫(yī)用凈化工作臺(YJ1450D)，（蘇州凈化設備公司）；高速冷凍離心機，（美國Thermo公司）；低速離心機(KDC40)，（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；電熱恒溫水槽(DK8D)，（上海躍進醫(yī)療器械廠）；倒置顯微鏡，（日本奧林巴斯公司）；倒置熒光相差顯微鏡，型號：DMI3000B（德國，徠卡儀器有限公司）；酶標儀（美國BioTek公司）；電熱恒溫干燥箱，（上海躍進醫(yī)療器械廠）；恒溫CO2培養(yǎng)箱，（美國Thermo公司）；立式壓力蒸汽滅菌器，型號LDZX—50KBS，（上海申安醫(yī)療儀器廠）。 NIH 3T3小鼠成纖維細胞培養(yǎng)以下各項操作均在無菌細胞室進行，NIH 3T3細胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基、37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱。 NIH 3T3小鼠成纖維細胞復蘇（1）用具消毒：將培養(yǎng)細胞需要用到的培養(yǎng)瓶、槍頭高壓蒸汽滅菌30min，并放于電熱恒溫干燥箱干燥24小時后，取出置于超凈工作臺備用；（2）配制培養(yǎng)基：將RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗按照90%：10%：1%的比例配好備用；（3）將凍存的NIH 3T3細胞從液氮中取出，快速放入37 ℃的恒溫水浴箱中，使之融化；（4）將融化的NIH 3T3消毒放入超凈臺，用微量移液器將其轉移到培養(yǎng)瓶中，并加入配制好的培養(yǎng)基5—10mL；（5）將培養(yǎng)瓶放于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（6）24 h后，棄除舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 NIH 3T3小鼠成纖維細胞傳代（1）倒置顯微鏡下觀察細胞，當細胞處于80％90％匯合階段時進行傳代培養(yǎng)；（2）倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用5—10mL無菌PBS水洗滌1—2次，然后想瓶內加入500μL %的胰蛋白酶消解細胞；（3）室溫下放置13 min，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶，當細胞質回縮至細胞形態(tài)近圓形時，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培養(yǎng)基終止消解，輕輕吹打瓶壁細胞，使之從培養(yǎng)瓶中脫離，形成細胞懸液；（4）將細胞懸液轉移到10mL的離心管中，2000轉離心10min；（5）倒掉上清液，加入1mL培養(yǎng)基使細胞分散均勻，分裝入數個培養(yǎng)瓶中，一般1: 3傳代，但是本實驗由于時間有限，為了讓細胞快速生長，進行1:2傳代。補充配置好的培養(yǎng)基5—10mL，將細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 NIH 3T3小鼠成纖維細胞計數（1）%胰蛋白酶將貼壁的細胞消化下來，使之形成細胞懸液；（2）取計數用載玻片，蓋上蓋玻片，吸取少量細胞懸液滴到載玻片上，使載玻片與蓋玻片之間充滿細胞懸液；（3）倒置顯微鏡下計數載玻片上4個角的大計數格內的細胞總數。 NIH 3T3小鼠成纖維細胞凍存（1）用胰蛋白酶消化細胞，脫壁后，立即用培養(yǎng)液中止消化，用巴氏吸管輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。（2）室溫下1000 rpm離心5 min。（3）加入適量的培養(yǎng)液， mL2 mL。（4）加入1/10體積的DMSO，混合均勻。（5）分裝至凍存管內，并將凍存管置于保溫盒內，置于4℃冰箱2小時，取出，置于20℃冰箱2小時，取出，置于80℃冰箱保存。 7860腎癌細胞培養(yǎng)以下各項操作均在無菌細胞室進行，NIH 3T3細胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基、37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱。 7860腎癌細胞復蘇（1）用具消毒：將培養(yǎng)細胞需要用到的培養(yǎng)瓶、槍頭高壓蒸汽滅菌30min，并放于電熱恒溫干燥箱干燥24小時后，取出置于超凈工作臺備用；（2）配制培養(yǎng)基：將RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清