【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的液體粹取蒸發(fā)完，得到淡黃色透明液體，即胱胺。本實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)沉淀法制備Fe3O4納米粒子，并通過(guò)透射電鏡、MRI響應(yīng)、傅里葉紅外光譜分析對(duì)制備的Fe3O4納米粒子的特性進(jìn)行表征；通過(guò)MRI響應(yīng)、傅里葉紅外光譜分析對(duì)制備的PEGGd2O3納米粒子的特性進(jìn)行表征；通過(guò)傅里葉紅外光譜分析對(duì)制備的胱胺進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Fe3O4納米粒子、PEGGd2O3納米粒子以及“連接物”胱胺制備成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3 可激活MRI納米探針Fe3O4SSGd2O3的制備為了確定可激活對(duì)比劑中四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子和氧化釓（PEGGd2O3）的最佳濃度，需要四氧化三鐵和氧化釓的濃度進(jìn)行優(yōu)化處理。用控制單一變量的方法，首先確定一個(gè)氧化釓的量，通過(guò)改變四氧化三鐵的濃度，配制溶液進(jìn)行MRI掃描，得到四氧化三鐵的最佳濃度；然后再同理按照上述方法，確定最佳氧化釓和谷胱甘肽的濃度。 Fe3O4SSGd2O3的傅里葉變換紅外光譜分析為了驗(yàn)證Fe3O4表面及PEGGd2O3表面的羧基與胱胺上的氨基共價(jià)結(jié)合成Fe3O4SSGd2O3納米探針，我們將稀釋的Fe3O4COOH、PEGGd2OGd2O3cystamine和Gd2O3SS Fe3O4納米探針進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析。紅外光譜分析的結(jié)果用Origin作圖。 納米探針組裝的紅外光譜圖，出現(xiàn)游離的氨基，在33003500cm1之間出現(xiàn)雙峰，同時(shí)羧基中的C=O向低頻移動(dòng)，為酰氨鍵中的C=O，與Fe3O4COOH進(jìn)一步結(jié)合后，游離的NH2消失，說(shuō)明與Fe3O4上的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)。說(shuō)明Fe3O4SSGd2O3納米探針共價(jià)組裝的成功制備。（Fe3O4）納米粒子對(duì)MRI信號(hào)的影響首先準(zhǔn)備PEGGd2O3SSNH2：取一定量的PEGGd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N羥基琥珀酰亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時(shí)。，編號(hào)為1—5，在其中都加入500μL的PEGGd2O3SSNH2；（）、100μL（其中含F(xiàn)e3O4 ）、150μL（其中含F(xiàn)e3O4 ）、200μL（其中含F(xiàn)e3O4 ）、250μL（其中含F(xiàn)e3O4 ）；、110μL、配成總量一定的5個(gè)溶液。用高速冷凍離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)每分的條件離心10min，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成5個(gè)Fe3O4濃度不同的Fe3O4SSGd2O3溶液。為了便于對(duì)比分析，每個(gè)樣品分別配2管掃M(jìn)RI，其中一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（10mM GSH）。制成共10個(gè)樣品掃M(jìn)RI。 不同濃度Fe3O4下GSH的MRI信號(hào)響應(yīng)，當(dāng)有谷胱甘肽存在時(shí)，磁共振信號(hào)比沒(méi)有谷胱甘肽時(shí)的磁共振信號(hào)亮度明顯增強(qiáng)，圖像的信噪比最大。所以，，圖像信噪比最大，圖像質(zhì)量最高。（PEGGd2O3）對(duì)MRI信號(hào)的影響首先也是準(zhǔn)備PEGGd2O3SSNH2：取一定量的PEGGd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N羥基琥珀酰亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時(shí)。由于本實(shí)驗(yàn)中Fe3O4的量固定不變，所以EDC和NHS的量都不需改變。，四氧化三鐵的最佳濃度為：，所以在討論氧化釓的最佳濃度時(shí)，四氧化三鐵的濃度取最佳濃度。，選擇氧化釓量為500μL，因此本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的氧化釓的濃度改變時(shí)必須包括500μL。，編號(hào)為1—7，；然后分別在7個(gè)EP管中加入制備好的PEGGd2O3SSNH2100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、800μL；再用移液器分別在5個(gè)EP管中加入蒸餾水700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、0μL，配成總量一定的7個(gè)溶液。用高速冷凍離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)每分的條件離心10min，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成7個(gè)PEGGd2O3濃度不同的Fe3O4SSGd2O3溶液。為了便于對(duì)比分析，每個(gè)樣品分別配2管掃M(jìn)RI，其中一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（10mM GSH）。制成共14個(gè)樣品掃M(jìn)RI。 不同濃度PEGGd2O3下GSH的MRI信號(hào)響應(yīng)，當(dāng)有谷胱甘肽存在時(shí)，磁共振信號(hào)比沒(méi)有谷胱甘肽時(shí)的磁共振信號(hào)明顯變明亮許多，當(dāng)PEGGd2O3為500μL時(shí)，圖像信噪比最大。所以認(rèn)為PEGGd2O3的最佳濃度為500μL，當(dāng)PEGGd2O3濃度為500μL時(shí)，圖像信噪比最大，圖像質(zhì)量最高。（GSH）對(duì)T1弛豫率的影響，分別編號(hào)為a1a7（沒(méi)有谷胱甘肽）、p1p7（有谷胱甘肽），在a1a7中分別加入250μL Fe3O4SSGd2O10μL蒸餾水，200μL Fe3O4SSGd2O60μL蒸餾水，150μL Fe3O4SSGd2O110μL蒸餾水，100μL Fe3O4SSGd2O160μL蒸餾水，50μL Fe3O4SSGd2O210μL蒸餾水，25μL Fe3O4SSGd2O235μL蒸餾水，260蒸餾水。p1p7中Fe3O4SSGd2O3分別與a1a7相同。 GSH對(duì)不同濃度PEGGd2O3的MR信號(hào)T1弛豫率影響，當(dāng)有谷胱甘肽存在時(shí)，不同濃度氧化釓的MR信號(hào)T1弛豫時(shí)間的回歸方程為：y=+，即有谷胱甘肽存在時(shí)。然而，當(dāng)沒(méi)有谷胱甘肽時(shí)，不同濃度氧化釓的MR信號(hào)T1弛豫時(shí)間的回歸方程為：y=+，即沒(méi)有谷胱甘肽存在時(shí)。也就是說(shuō)，有谷胱甘肽存在時(shí)的弛豫率是沒(méi)有谷胱甘肽時(shí)的近3倍，說(shuō)明所制備的納米探針對(duì)谷胱甘肽有靈敏的MR響應(yīng)，有望用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH的MRI。（GSH）的MRI信號(hào)響應(yīng)同理制備Fe3O4SSGd2O33mL，編號(hào)為112，在12個(gè)EP管中都加入150μL Fe3O4SSGd2O3，112號(hào)EP管中分別加入110μL蒸餾水,109μL 蒸餾水、 GSH、 蒸餾水，1μL GSH， GSH、108μL蒸餾水， GSH、107μL蒸餾水， GSH、106μL蒸餾水， GSH、105μL蒸餾水， GSH、104μL蒸餾水， GSH、103μL蒸餾水， GSH、102μL蒸餾水， GSH、101μL蒸餾水， GSH、100μL蒸餾水制成總量為260μL的12個(gè)樣品。 不同濃度GSH的MRI T1弛豫率由于腫瘤組織中GSH含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織，當(dāng)GSH濃度大于等于4mmol/L時(shí)，T1弛豫時(shí)間改變明顯，文獻(xiàn)記載腫瘤組織的GSH含量大于5mmol。因此可激活納米探針可以把腫瘤組織和正常組織區(qū)分開(kāi)。達(dá)到特異性診斷腫瘤的目的。 討論本章節(jié)首先通過(guò)控制單一變量的方法對(duì)制備的可激活磁共振對(duì)比劑Fe3O4SSGd2O3納米探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化，PEGGd2O3的最佳濃度為500μL；然后通過(guò)比較有無(wú)谷胱甘肽存在時(shí)材料的MRI 掃描T1弛豫率，數(shù)據(jù)表明當(dāng)有谷胱甘肽存在時(shí)，T1弛豫率明顯提高，對(duì)比效果更佳，且當(dāng)GSH濃度超過(guò)3mol/L時(shí)，弛豫率明顯改變，而腫瘤組織中GSH高表達(dá)，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的特異性診斷；最后通過(guò)傅里葉紅外光譜分析對(duì)材料進(jìn)行表征并比較，證明可激活磁共振對(duì)比劑Fe3O4SSGd2O3納米探針制備成功。4 可激活MRI納米探針Fe3O4SSGd2O3的MTT測(cè)試隨著免疫學(xué)、血液學(xué)和腫瘤學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，科研部門(mén)和臨床醫(yī)院檢測(cè)各種細(xì)胞和細(xì)胞因子活性等方面的工作日益增多，但是其檢測(cè)方法多不盡人意。細(xì)胞毒性檢測(cè)的方法有很多種，如MTT 法，CCK8 法，LDH 法等。這些方法雖各具優(yōu)點(diǎn)，但都存在局限性。自從1983年美國(guó)學(xué)者M(jìn)osmamn建立了MTT比色法以來(lái)，以其快速、靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)受到人們的普遍重視，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，例如檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的敏感性，刺激劑對(duì)免疫細(xì)胞的反應(yīng)、免疫細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子活性等[41]。因此本文選用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。MTT產(chǎn)品為淡黃色粉末，易被水溶解和透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可被活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原，形成不溶于水的藍(lán)紫色甲躦（Formazam）結(jié)晶。該結(jié)晶可溶于酸性異丙醇、二甲亞砜、SDS等有機(jī)溶劑中，再通過(guò)酶標(biāo)儀依顏色深淺測(cè)定出各吸光度值。由于結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成比例，因此吸光度值的大小可反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量及活性。為了將制備得到的Fe3O4SSGd2O3可激活對(duì)比劑用于腫瘤細(xì)胞的MRI診斷，首先利用MTT測(cè)試考察了該納米探針的生物相容性。 實(shí)驗(yàn)試劑及器材（1）所用試劑：乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），（美國(guó)Sigma公司）；N羥基琥珀酰亞胺（NHS），（美國(guó)Sigma公司）；改良型RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司）；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司）；磷酸鹽緩沖液(PBS，自配)；MTT粉末；胰酶（美國(guó)Giboc公司）；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)PIERCE公司）。（1）所用器材：80℃冰箱，(日本SANYO公司)；4℃冰箱，（中國(guó)海爾集團(tuán)）；20℃冰箱，（中國(guó)海爾集團(tuán)）；培養(yǎng)板，（美國(guó)Corning公司）；培養(yǎng)瓶，（美國(guó)Corning公司）；15 mL及50 mL離心管，（美國(guó)Corning公司）；EP管，（美國(guó)AXYGEN公司）；漩渦混合器(XHC)，（金壇市白塔新寶儀器廠）；20 mL、100 mL、1000 mL微量移液器，（德國(guó)Eppendorf公司）；移液器槍頭，（美國(guó)AXYGEN公司）；醫(yī)用凈化工作臺(tái)(YJ1450D)，（蘇州凈化設(shè)備公司）；高速冷凍離心機(jī)，（美國(guó)Thermo公司）；低速離心機(jī)(KDC40)，（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；電熱恒溫水槽(DK8D)，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；倒置顯微鏡，（日本奧林巴斯公司）；倒置熒光相差顯微鏡，型號(hào)：DMI3000B（德國(guó)，徠卡儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；恒溫CO2培養(yǎng)箱，（美國(guó)Thermo公司）；立式壓力蒸汽滅菌器，型號(hào)LDZX—50KBS，（上海申安醫(yī)療儀器廠）。 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)以下各項(xiàng)操作均在無(wú)菌細(xì)胞室進(jìn)行，NIH 3T3細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基、37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱。 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞復(fù)蘇（1）用具消毒：將培養(yǎng)細(xì)胞需要用到的培養(yǎng)瓶、槍頭高壓蒸汽滅菌30min，并放于電熱恒溫干燥箱干燥24小時(shí)后，取出置于超凈工作臺(tái)備用；（2）配制培養(yǎng)基：將RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗按照90%：10%：1%的比例配好備用；（3）將凍存的NIH 3T3細(xì)胞從液氮中取出，快速放入37 ℃的恒溫水浴箱中，使之融化；（4）將融化的NIH 3T3消毒放入超凈臺(tái)，用微量移液器將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，并加入配制好的培養(yǎng)基5—10mL；（5）將培養(yǎng)瓶放于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（6）24 h后，棄除舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞傳代（1）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于80％90％匯合階段時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；（2）倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用5—10mL無(wú)菌PBS水洗滌1—2次，然后想瓶?jī)?nèi)加入500μL %的胰蛋白酶消解細(xì)胞；（3）室溫下放置13 min，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮至細(xì)胞形態(tài)近圓形時(shí)，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培養(yǎng)基終止消解，輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從培養(yǎng)瓶中脫離，形成細(xì)胞懸液；（4）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到10mL的離心管中，2000轉(zhuǎn)離心10min；（5）倒掉上清液，加入1mL培養(yǎng)基使細(xì)胞分散均勻，分裝入數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶中，一般1: 3傳代，但是本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間有限，為了讓細(xì)胞快速生長(zhǎng)，進(jìn)行1:2傳代。補(bǔ)充配置好的培養(yǎng)基5—10mL，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)（1）%胰蛋白酶將貼壁的細(xì)胞消化下來(lái)，使之形成細(xì)胞懸液；（2）取計(jì)數(shù)用載玻片，蓋上蓋玻片，吸取少量細(xì)胞懸液滴到載玻片上，使載玻片與蓋玻片之間充滿(mǎn)細(xì)胞懸液；（3）倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)載玻片上4個(gè)角的大計(jì)數(shù)格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。 NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞凍存（1）用胰蛋白酶消化細(xì)胞，脫壁后，立即用培養(yǎng)液中止消化，用巴氏吸管輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。（2）室溫下1000 rpm離心5 min。（3）加入適量的培養(yǎng)液， mL2 mL。（4）加入1/10體積的DMSO，混合均勻。（5）分裝至凍存管內(nèi)，并將凍存管置于保溫盒內(nèi)，置于4℃冰箱2小時(shí)，取出，置于20℃冰箱2小時(shí)，取出，置于80℃冰箱保存。 7860腎癌細(xì)胞培養(yǎng)以下各項(xiàng)操作均在無(wú)菌細(xì)胞室進(jìn)行，NIH 3T3細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基、37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱。 7860腎癌細(xì)胞復(fù)蘇（1）用具消毒：將培養(yǎng)細(xì)胞需要用到的培養(yǎng)瓶、槍頭高壓蒸汽滅菌30min，并放于電熱恒溫干燥箱干燥24小時(shí)后，取出置于超凈工作臺(tái)備用；（2）配制培養(yǎng)基：將RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清