【正文】 ，L半胱氨酸10mmol/L，ATP ，測定整個發(fā)酵過程的各項指標變化。如果胞內(nèi)的這些前體物質(zhì)不能滿足GSH合成的需要，就將成為進一步提高GSH產(chǎn)量的限制性因素[57]。 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH進程曲線的繪制GSH在生物體內(nèi)是由γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH Ⅱ)在ATP存在的條件下，催化L谷氨酸、L半胱氨酸和甘氨酸進行序貫反應(yīng)而形成的[56]。 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗結(jié)果 改變搖瓶裝液量會影響發(fā)酵液的溶氧濃度，從而影響菌體對GSH的積累。 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗結(jié)果氧是構(gòu)成細胞本身及其代謝產(chǎn)物的成分之一，雖然培養(yǎng)基中大量存在的水及其他成分可以提供氧元素，但許多微生物細胞必須利用分子態(tài)的氧作為呼吸鏈電子系統(tǒng)末端的電子受體，在電子傳遞過程中釋放出大量能量供細胞維持生長和代謝作用，氧是一種難溶氣體，在室溫和常壓條件下，純氧的溶解度僅為36mg/L，空氣中氧的溶解度僅為8mg/L，當水中溶有糖和其它物質(zhì)時，氧的溶解度更低，啤酒酵母Y14的發(fā)酵過程是好氧發(fā)酵過程，因此，在它發(fā)酵時必須不斷的向培養(yǎng)液供給足夠的氧以滿足其生長代謝的需要，但過大的溶氧又會抑制菌體的生長代謝，因此，適宜的溶氧能提高代謝產(chǎn)物的濃度，而在實驗室搖瓶發(fā)酵過程中溶氧濃度是通過搖床轉(zhuǎn)速控制的。 發(fā)酵初始pH值的優(yōu)選試驗結(jié)果發(fā)酵液的pH除了對細胞發(fā)生直接影響之外，如影響細胞的通透性，還對細胞產(chǎn)生不同的間接影響，例如，影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性，以及影響代謝反應(yīng)中各種酶的活性等，因此，發(fā)酵液的pH也是影響微生物生長繁殖的最重要因素之一。一般而言，隨著溫度的增加，生長速率也會增加，但機體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸等對溫度都比較敏感，如果溫度上升到一定程度將會對機體產(chǎn)生不利影響，此外，過高或過低的溫度都會使細胞膜的正常功能喪失，因此，應(yīng)選擇最適的培養(yǎng)溫度。此時。 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗結(jié)果，GSH產(chǎn)量的最大值出現(xiàn)在60h，60h后GSH產(chǎn)量開始出現(xiàn)下降趨勢；而生物量在52h達到最大，52h后趨于穩(wěn)定；GSH含量在60h達到最大，60h后變化甚微。觀察整個發(fā)酵過程的各項指標變化。 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗在其他發(fā)酵條件不變時，考察了當搖瓶裝液量分別為30mL/300mL、50mL/300mL、70mL/300mL、90mL/300mL、110mL/300mL時，Y14酵母菌產(chǎn)GSH所得到的細胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗在其他發(fā)酵條件不變時，、7時，啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH所得到的細胞干重、胞內(nèi)GSH含量、發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量。 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗啤酒酵母Y14連續(xù)培養(yǎng)12小時，后每隔8小時取樣測量生物量及GSH產(chǎn)量。 主要試劑L谷氨酸BR中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司L半胱氨酸AR武漢市華順生物技術(shù)有限公司甘氨酸BR中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司ATPBR上海源聚生物科技有限公司 主要儀器同第2章。 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖 20，酵母膏10，(NH4)2SO4 8，KH2PO4 3，MgSO4 ，水1000mL。 培養(yǎng)基： 斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5，瓊脂20。本章在前一章發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選試驗的基礎(chǔ)上，利用單因素試驗分別研究了啤酒酵母Y14發(fā)酵最適溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量及添加前體氨基酸和ATP對GSH產(chǎn)量的影響，并確定其最優(yōu)發(fā)酵條件。Miyamoto等[52]，向培養(yǎng)基中添加L半胱氨酸可以使胞內(nèi)GSH含量大幅度提高，Watanabe等[53]發(fā)現(xiàn)。國內(nèi)對面包酵母和重組大腸桿菌發(fā)酵過程中的溫度、pH值、搖瓶裝液量等環(huán)境條件的影響已有較多研究，但GSH的產(chǎn)量均值仍不理想。pH影響細胞對營養(yǎng)成分的吸收及代謝途徑，從而影響細胞生長及GSH積累。影響發(fā)酵產(chǎn)量的環(huán)境參數(shù)主要有溫度、pH、溶解氧等。對優(yōu)化配方進行驗證試驗。 Fixed levels：X1=0 Fixed levels：X2=0 Fixed levels：X3=0 GSH產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖 Response surface analysis of GSH yield 結(jié)論PlackettBurman設(shè)計法是一種經(jīng)濟且有效的試驗設(shè)計方法，它能快速、有效地從眾多因子中篩選出能促進啤酒酵母Y14高產(chǎn)GSH的因子；響應(yīng)面法(RSM) 能快速對主要影響因子進行優(yōu)化與評價，并能得到各因素最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。可見該模型能較好預(yù)測發(fā)酵所產(chǎn)GSH產(chǎn)量。在最優(yōu)條件下：葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4分別為20g/L、10 g/L、8 g/L 時，預(yù)測GSH 。變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度，CV 值越低模型的置信度越高,%，說明模型方程能夠很好地反映真實的試驗值。經(jīng)F檢驗，模型中的參數(shù)X1，X2，X1X1，X2X2，X3X3 都是顯著的(Pr )。 BoxBehnken試驗因素與水平 The factors and levels of variables used in BoxBehnken design試驗因素代碼編碼水平/(g/L)10+1葡萄糖X1102030酵母膏X251015(NH4) 2SO4X34810 BoxBehnken試驗設(shè)計和試驗結(jié)果 Experimental design and results of BoxBehnken 試驗編號X1X2X3Y**111021103110411050116011701180119101101011110112101130001400015000采用國際權(quán)威的SAS軟件回歸擬合表試驗數(shù)據(jù)，可以得到二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ蜑閅=+X1+X1X1X2X3X3式中，Y代表GSH產(chǎn)量，XXX3分別代表培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4的濃度(g/L)。所以對應(yīng)的因素葡萄糖，酵母膏和(NH4)2SO4對GSH的產(chǎn)量具有顯著性的影響，而其它的因素顯著性較小。Pr ，Pr 。 PlackettBurman試驗因素與水平 The factors and levels of variables used in the PlackettBurman design試驗因素代碼 ()低水平（g/L）(+)高水平（g/L）酵母膏X139蔗糖X2010蛋白胨X3010K2H PO4X426酪蛋白X5010葡萄糖X6010MgSO4X7麥芽糖X8010NaClX926(NH4) 2SO4X10412乳糖X11010可溶性淀粉X12010Cacl2X1303尿素X14010 PlackettBurman試驗設(shè)計和結(jié)果 Experimental design and results of PlackettBurman X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14Y**1111111111111112111111111111113111111111111114111111111111115111111111111116111111111111117111111111111118111111111111119111111111111111011111111111111111111111111111112111111111111111311111111111111141111111111111115111111111111111611111111111111注：Y**表示GSH產(chǎn)量，單位為mg/L。試驗數(shù)據(jù)均用SAS (version9. 0 , SAS Institute Ine , Cary , NC ,USA) 處理分析。再對該多元函數(shù)進行分析便可確定出其極值點以及取得極值的相應(yīng)的自變量的取值。試驗數(shù)據(jù)經(jīng)多項式回歸分析得到一個關(guān)于響應(yīng)值與自變量關(guān)系的二階模型，該方程即為描述響應(yīng)量(應(yīng)變量)和自變量(操作條件)關(guān)系的經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀?) BoxBehnken 設(shè)計對培養(yǎng)基成分的進一步優(yōu)化[51]　對PlackettBurman設(shè)計試驗篩選出的有較大影響因素，利用BoxBehnken設(shè)計對培養(yǎng)基進一步的優(yōu)化。 DTNB法檢測GSH含量[49]取樣液2mL，反應(yīng)數(shù)分鐘后顯色穩(wěn)定后于412nm處用分光光度計測定OD值。 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)用無菌的5mL移液管按10%的接種量吸取種子液3mL，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖瓶裝量30mL/300mL條件下發(fā)酵48h。7H2OAR金山縣興塔化工廠KH2PO4AR湖州化學(xué)試劑廠DTNBARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝98%GSHARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝 主要儀器GW722型可見分光光度計上海精密儀器有限公司3032電熱培養(yǎng)箱上海崇明實驗儀器廠HS80A恒溫搖床中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠320S pH計梅特勒托利多(上海)有限公司電子分析天平奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司15W紫外燈順德市展達電器廠CS1012電熱鼓風干燥箱中華人民共和國重慶試驗儀器設(shè)備廠珍珠牌凈化工作臺中華人民共和國蚌埠汽化設(shè)備廠 方法 菌株活化從保藏斜面中取一環(huán)菌種劃線于新鮮斜面培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，酵母膏5，(NH4)2SO4 ，KH2PO4 3 ，MgSO4 ，水1000mL。 培養(yǎng)基： 斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5，瓊脂20。本章以啤酒酵母Y14獲得GSH的產(chǎn)量為指標，采用PlackettBurman設(shè)計對影響GSH生產(chǎn)的14個營養(yǎng)因素進行考察，再用BoxBehnken 設(shè)計對培養(yǎng)基成分進一步優(yōu)化，對所得的實驗數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進行擬合，利用SAS(version9. 0, SAS Institute Ine , Cary , NC ,USA) 處理分析，確定最后的優(yōu)化結(jié)果。Udeh和Achremowics考察了培養(yǎng)基中的主要成分(葡萄糖、蛋白胨、KH2PO生物素和半胱氨酸) S8H細胞形成和胞內(nèi)GSH含量的影響，采用中心復(fù)合試驗設(shè)計(Central Composition Experimental Design)方法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，%，與優(yōu)化前的情況相比提高近一倍[47]。要想進一步提高菌株的生物量和胞內(nèi)合成GSH能力，必須對培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分進行優(yōu)化，確定適合菌株生長最適培養(yǎng)基。GSH產(chǎn)量（mg/L）=GSH含量（mg/g） 生物量（g/L）第2章 啤酒酵母Y14發(fā)酵GSH培養(yǎng)基的優(yōu)化生產(chǎn)GSH的酵母大都是工業(yè)常用菌株，這些菌株能在寬松的培養(yǎng)條件下生長并積累GSH，但產(chǎn)量往往很低。 常用研究指標的說明為了避免重復(fù)，在此對本論文所用到的各項研究指標進行簡要說明。以GSH吸附率、GSH回收率、蛋白質(zhì)去除率、濃縮倍數(shù)、純化倍數(shù)為主要指標，研究確定大孔樹脂D001分離GSH的最適上樣濃度、上樣pH、上樣流速、洗雜質(zhì)用液種類、洗脫液種類與濃度及洗脫流速。利用單因素試驗對啤酒酵母Y14生產(chǎn)GSH發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定搖瓶發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速及裝液量的最優(yōu)值。 目的研究目的：在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，用實驗室現(xiàn)有的富含GSH的啤酒酵母Y14進行發(fā)酵生產(chǎn)GSH工藝的優(yōu)化