【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 LB 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒 ，鏈接產(chǎn)物 。 序列測(cè)定 鑒定 后的 克隆 送至 上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到 NCBI 中核 酸數(shù)據(jù)庫(kù)做 BLAST 同源性檢索，并利用 Clustal X 軟件對(duì)所得序列進(jìn)行 分析。 4 結(jié)果與分析 RNA 電泳結(jié)果分析 RNA 樣品的凝膠電泳分析是判斷 RNA 質(zhì)量的一種重要手段，從電泳膠上 28S rRNA 和 18S rRNA 的完整性可以判斷 RNA 有無(wú)降解及降解程度，也可以判斷有無(wú)DNA 污染。 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 9 采用改良 Bugos 法提取紅肉蜜柚突變體及其親本琯溪蜜柚果實(shí)總 RNA，色澤白，較為透明，易于溶解。樣品經(jīng)電泳檢測(cè)表明，提取出總 RNA 能清楚地看到 28S rRNA 和 18S rRNA 兩條 RNA 條帶，提取的 RNA 完整，沒有發(fā)生降解。 圖 11 果肉 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖譜 注： 1. 紅肉蜜柚； 2. 琯溪 蜜柚 RNA 紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果分析 一般情況下，紫外測(cè)定結(jié)果 OD260/OD280比值為 ， OD260/OD230比值大于 時(shí)認(rèn)為獲得的 RNA 樣品較純凈。當(dāng) OD260/OD280比值小于 時(shí)，可能有蛋白 表 15 總 RNA 比色測(cè)定結(jié)果 紫外比色及比值 樣品名稱 紅肉蜜柚 琯溪蜜柚 RNA 的含量 ng/μL ng/μL OD260/OD280 OD260/OD230 質(zhì)污染； OD260/OD230比值小于 時(shí)， RNA 樣品可能還有其它如酚類化合物的干擾物存在 [12]。從表 15 測(cè)定結(jié)果可以看出， OD260/OD230的吸光度比值大于 ，說(shuō)明沒有多糖、鹽或其他雜質(zhì)的重大污染。 OD260/OD280處的吸光度比值接近 ，說(shuō)明也沒有蛋白質(zhì)的重大污染，故用此法所提總 RNA 純度較好，所以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 純化后的 RNA 電泳結(jié)果分析 采用改良 Bugos 法提取所得 RNA 存在一定的 DNA 污染，因而應(yīng)用這些樣品進(jìn)行 RTPCR 或其它操作前應(yīng)先用 Dnase 去除 DNA，或?qū)Ρ痉椒ㄋ?RNA 進(jìn)行再次 LiCl 沉淀以進(jìn)一步去除 DNA。從圖 12 來(lái)看，提取的樣品已無(wú) DNA 的污染。 1 2 1 2 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 10 圖 12 果肉 RNA 純化后的電泳圖譜 注： 1. 紅肉蜜柚； 2. 琯溪蜜柚 合成的 cDNA 電泳結(jié)果分析 從圖 13 來(lái)看，合成的 cDNA 二鏈呈彌散狀， 在 500~750 bp 間有特征帶的出現(xiàn)，表明該物種果實(shí)中大部分基因的長(zhǎng)度都在該區(qū)間內(nèi)。 圖 13 cDNA 二鏈電泳圖譜 注： M. marker； 1. 紅肉蜜柚； 2. 琯溪蜜柚； 3. 陰性對(duì)照 PSY 基因的克隆 琯溪蜜柚與 紅肉蜜柚 PSY PCR 結(jié)果顯示，兩者擴(kuò)增片段大小相同，均擴(kuò)增出單一的條帶，大約為 1300 bp， 將片段回收，連接至 T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室初步驗(yàn)證正確后送上海英杰公司測(cè)序。 序列性分析 將測(cè)序結(jié)果整理如下（方框內(nèi)為 PCR 擴(kuò)增 時(shí) 所使用引物），測(cè)序結(jié)果表明，紅肉蜜柚和琯溪蜜柚 PSYcDNA 均長(zhǎng) 1317 bp， 與 NCBI 網(wǎng)站上其他相似序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該 DNA 序列 包含完整的閱讀框，編碼 423 個(gè)氨基酸。 （ 1） 紅肉蜜柚果實(shí) PSY 基因全序列（紅肉蜜柚 PSY 基因進(jìn)行了兩次測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全一 致）： ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGT 1 2 M 1 2 3 1300bp—— 正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 11 TCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGGCTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTAATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGGAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACAGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAGGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTTTATCTACCACAAGATGAGTTGGCATAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACCTCATGAAGAACCAAATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAGGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA 將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)站比對(duì)，結(jié)果如表 16。 表 16 紅肉蜜柚果實(shí) PSY 基因測(cè)序結(jié)果比對(duì) Accession Description Max score Total score Query coverage Maxident gi|166343817| Citrus maxima phytoene synthase mRNA, plete cds 2448 2448 100% 99% gi|82394886| Citrus sinensis phytoene synthase mRNA, plete cds 2402 2402 100% 98% gi|6959859| Citrus unshiu phytoene synthase (Psy1) mRNA, plete cds 2402 2402 100% 98% gi|11344506| Citrus unshiu mRNA for phytoene synthase, plete cds 2402 2402 100% 98% 續(xù)表 16 gi|166343815| X Citrofortunella mitis phytoene synthase mRNA, plete cds 2390 2390 100% 98% gi|13542331| Citrus x paradisi phytoene synthase mRNA, plete cds 2384 2384 100% 98% 注： Citrus maxima：文旦； Citrus sinensis：甜橙； Citrus unshiu：溫州蜜柑； Citrofortunella mitis：正文： 紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚 PSY 基因的分離 12 四季橘； Citrus paradisi：葡萄柚 通過(guò)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)： ① 紅肉蜜柚果實(shí) PSY 基因與柑桔屬 PSY 基因同源性都相對(duì)較高，其中與柚 PSY 基因（ No. 166343817） 同源性最高； ② 與柚 PSY 基因（ No. 166343817）比對(duì)發(fā)現(xiàn)：有一個(gè) TAA 的 gap 存在； 9 個(gè)堿基不匹配。 （ 2） 野生型琯溪蜜柚 PSY 基因全序列 ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGTTCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGACTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTGATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGAAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACGGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAAGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTATATCTGCCACAAGATGAGTTGGCACAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAACCAGATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAAGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA 將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 網(wǎng)站比對(duì)，結(jié)果如表 17。 表 17 琯溪蜜柚果實(shí) PSY 基因測(cè)序結(jié)果比對(duì) Accession Description Max score Total score Query coverage Maxident gi|166343817| Citrus maxima phytoene synthase mRNA, plete cds 2442 2442 100% 98% 正文：