不同親本數(shù)目的中間球海膽群體遺傳結(jié)構(gòu)研究畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2024-07-25 11:10 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 Taq (5U/ul)ddH2OTotal25ul2. PCR反應(yīng)條件①預(yù)變性：94℃，5分鐘；②變 性：94℃，40秒；③退 火：退火溫度 40秒；④延 伸：72℃，1分鐘；⑤循 環(huán)：從2到4共34個(gè)循環(huán)；⑥ 72℃下最后延伸5分鐘；⑦ 4℃保存。3. 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離制膠： ① 30%丙烯酰胺貯備液：丙烯酰胺（Acrylamide）固體 145gN,N′甲叉雙丙烯酰胺（Methylene bisacrylamide） 5g加入500ml超純水，32℃水浴攪拌溶解備用。② 5TBE Buffer（2L）Tris 109gEDTA HBO3 超純水定容至2L③ 10%過硫酸銨10g過硫酸銨固體溶解于100ml超純水中，4℃避光保存。④ TEMED(N,N,N′,N′四甲基乙二胺)，4℃避光保存。⑤ 8%PAGE膠制備30%丙烯酰胺 5TBE Buffer 超純水 10%過硫酸銨 TEMED 灌膠：8%PAGE膠配置好后，后立即灌膠，室溫凝膠1小時(shí)以上，膠厚約為1mm。電泳：組裝電泳槽，放入緩沖液（1TBE），于200V預(yù)電泳20分鐘，將PCR產(chǎn)物與3ul上樣緩沖液混合，每個(gè)點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣3ul，200V電泳2小時(shí)。染色和顯色： ① 電泳結(jié)束后，將膠取下，用純水沖洗一次，染液（超純水）中染色10分鐘。② 再將膠用純水沖洗一次。③ 配置顯色液（10gNaOH、加入23ml甲醛），將膠在顯色液中顯色到適合程度為止。④ 用純水沖洗，停止染色。微衛(wèi)星產(chǎn)物電泳結(jié)果經(jīng)肉眼觀察，將每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因依據(jù)片斷大小分別命名為A、B、C、按照共顯性標(biāo)記進(jìn)行基因型統(tǒng)計(jì)，帶型不清晰或多次擴(kuò)增未見產(chǎn)物的個(gè)體用“..”表示。結(jié)果輸入Popgene32軟件，進(jìn)行分析。根據(jù)Nei法分別求算大小兩個(gè)海膽群體的基因多樣性（Nei指數(shù)）：H = (Nei，1974；Nei，1978)。其中qi為第i個(gè)位點(diǎn)上的等位基因數(shù)，n為檢測到的位點(diǎn)數(shù)。Ht為種群內(nèi)總的基因多樣性，計(jì)算公式為：n為位點(diǎn)總數(shù)，和分別為總的種群中I位點(diǎn)上的顯性頻率和隱性頻率。Hs為種群內(nèi)的基因多樣性。Shannon指數(shù)(I)的計(jì)算公式為：，其中為產(chǎn)物條帶的表型。第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)在Zhou等[20]開發(fā)的中間球海膽微衛(wèi)星引物中，挑選多態(tài)性較好、擴(kuò)增帶型清晰的10對(duì)引物，用于中間球海膽稚膽的微衛(wèi)星擴(kuò)增及群體遺傳多樣性分析。引物序列及相應(yīng)參數(shù)見表2。所有引物在P7和P3海膽群體中均擴(kuò)增出24個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出23個(gè)等位基因，片段大小在100400bp之間。其中引物INTS20在部分海膽個(gè)體的擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。表2. 實(shí)驗(yàn)所用微衛(wèi)星引物序列及相應(yīng)參數(shù) Details of microsatellite primers of sea urchin引物名稱引物序列（5′3′）退火溫度（℃）等位基因數(shù)（個(gè)）ST52ST21INTS01F:TTTGGGTGGATCCTGTCGTG5922R:TCACAATTCCGTCAGGGCTCINTS02F:TGTATGGTCTGTCGGAAAGC5522R:GATGCAACAATTGACGGAGCINTS04F:GCGATTTGTAAACCTGGGGA5923R:AGGTAGGAGTCATGTCGTCGINTS10F:TGATGGTTTGGGGCATGA5733R:TGGTATGTCGGGAGTGTGAINTS12F:CTAGCGTGTGTCAAGCACG5722R:CGGAGTTGAAGCCGTTGTCINTS14F:GGGAAGTTTTCCCCACTGAC5733R:TGTCCATAACGCCACATTCGINTS19F:TCCATAGCAACCATGCAGC5722R:CCCTCGATAACAGCATCAGCINTS20F:GGTCTACAGACATCCAGTGC5922R:GCAAATGTTCAGGCTTCTGGST16F:CGTAAGAAACTTTTGGGG6132R:CCATACACCATTCAGGCTST24F:TCAGCTATTAGTGCCCTTTT5733R:TGCGAGTGTTTGTTTTGCtotal2424兩個(gè)群體各位點(diǎn)等位基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，基因型頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。由表可以看出， 等位基因INST02C，ST16C在P7群體中出現(xiàn)（f=），而在P3群體中缺失，而INST04C在P3群體中出現(xiàn)（f=），而在P7群體中未被檢測到。等位基因INST01A,INST02B,INST04C,INST10A,ST16B在P3群體中的頻率顯著高于P7群體中的頻率（P），而等位基因INST01B,INST02C,INST10C, INST14C,INST16C在P7群體中的頻率顯著高于P3群體中的頻率（P）。P7群體出現(xiàn)了37種基因型，而P3群體出現(xiàn)了28種基因型。100bp200bp300bp Amplification results of locus INTS20 in some individuals of sea urchin表3. P7和P3海膽稚膽群體10個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率 Allele frequency of 10 microsatellite loci in eightarmed P7 and P3 puerile sea urchin population位 點(diǎn)群體類型AB
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