【正文】 .................... 10致 謝................................................................12參考文獻(xiàn)............................................................. 13摘 要本實(shí)驗(yàn)利用10對(duì)微衛(wèi)星引物，對(duì)由不同親本數(shù)目所產(chǎn)生的中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。177。s expected heterozygosis were 177。李琪等[1]采用磁珠雜交選擇和 PCR篩選法,從長牡蠣DNA選擇片段文庫中 ,快速分離含有微衛(wèi)星序列的陽性克隆。海膽市場價(jià)格很高 ,消費(fèi)量卻非常大。 常亞青等[20]曾利用 RAPD 技術(shù)對(duì)5種經(jīng)濟(jì)海膽基因組多態(tài)性進(jìn)行了分析。 DNA提取1. 將每只海膽分離開來，蒸餾水反復(fù)沖洗。 性：94℃，40秒；③② 5TBE Buffer（2L）Tris 109gEDTA HBO3 超純水定容至2L③ 10%過硫酸銨10g過硫酸銨固體溶解于100ml超純水中，4℃避光保存。微衛(wèi)星產(chǎn)物電泳結(jié)果經(jīng)肉眼觀察，將每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因依據(jù)片斷大小分別命名為A、B、C、按照共顯性標(biāo)記進(jìn)行基因型統(tǒng)計(jì)，帶型不清晰或多次擴(kuò)增未見產(chǎn)物的個(gè)體用“..”表示。引物序列及相應(yīng)參數(shù)見表2。10個(gè)位點(diǎn)在兩個(gè)群體中分別擴(kuò)增出23個(gè)等位基因，177。177。177。微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果說明該方法可以得到較好的幼蟲模板DNA，可以用于后續(xù)的分子標(biāo)記分析。本實(shí)驗(yàn)所用海膽稚膽群體雜合度水平處于中等，但是用于產(chǎn)生這些個(gè)體的親本數(shù)均較少，推測將會(huì)存在不同程度的等位基因丟失、雜合度下降等的情況。致 謝本論文從選題的確定，論文的寫作、修改到最后定稿都是在指導(dǎo)老師秦副教授悉心指導(dǎo)下完成的。秦老師淵博的專業(yè)知識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無華、平易近人的人格魅力對(duì)我影響深遠(yuǎn)。另外統(tǒng)計(jì)了各群體的相似指數(shù)和雜合度，發(fā)現(xiàn)SS群體的相似指數(shù)低于LS,而雜合度高于LS群體。另外，該方法不但可以將微小的幼蟲階段納入到分子標(biāo)記的研究中來, 便于更全面的掌握海膽整個(gè)生命周期內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)變化動(dòng)態(tài),擴(kuò)大了海膽遺傳育種學(xué)的研究范圍和研究內(nèi)容，也為海膽標(biāo)記輔助育種等遺傳學(xué)研究工作提供了早期取樣研究的實(shí)例，大大簡化該方向的研究步驟，且節(jié)約了人力、物力及寶貴的時(shí)間。177。177。177。其中引物INTS20在部分海膽個(gè)體的擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。根據(jù)Nei法分別求算大小兩個(gè)海膽群體的基因多樣性（Nei指數(shù)）：H = (Nei，1974；Nei，1978)。⑤ 8%PAGE膠制備30%丙烯酰胺 5TBE Buffer 超純水 10%過硫酸銨 TEMED 灌膠：8%PAGE膠配置好后，后立即灌膠，室溫凝膠1小時(shí)以上，膠厚約為1mm。 火：退火溫度3. 加入1μl蛋白酶K（）4. 55℃恒溫裂解3h后，升溫到85℃保持15min以滅活蛋白酶K。耿慧君等[22]進(jìn)行了 中間球海膽野生和養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析，利用 28對(duì)微衛(wèi)星 DNA分子標(biāo)記對(duì)中間球海膽的 1個(gè)野生和 1個(gè)養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析。在海膽?zhàn)B殖及雜交育種等方面，王麗梅等[1213]進(jìn)行了中間球海膽與光棘球海膽的雜交的研究。徐鵬等[2]還以菌液為模板篩選到中國對(duì)蝦31個(gè)微衛(wèi)星DNA。 and 177。該研究首次建立了中間球海膽稚膽的固定、DNA提取方法并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，研究結(jié)果豐富了中間球海膽分子遺傳學(xué)內(nèi)容。所有海膽稚膽期采用直接裂解法提取基因組DNA，裂解液直接進(jìn)行微衛(wèi)星擴(kuò)增。177。, 177。具有數(shù)量多、在基因組中分布廣泛、多態(tài)性豐富、突變率高、呈孟德爾式共顯性遺傳、可以特異性的 PCR擴(kuò)增、穩(wěn)定性重復(fù)性好、引物通用性好、檢測快速方便、能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化等優(yōu)點(diǎn)，在研究物種遺傳多樣性分析、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源鑒定、基因組作圖和輔助育種等方面表現(xiàn)的優(yōu)越,為水生動(dòng)物的理論基礎(chǔ)研究提供了新的手段。譚杰等[5]運(yùn)用微衛(wèi)星DNA技術(shù)對(duì)仿刺參煙臺(tái)群體、威海群體大連群體的3個(gè)野生群各20個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳分析,結(jié)果表明威海群體和大連群體之間親緣關(guān)系較近,煙臺(tái)群體與前兩群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。王吉橋等[15]于2005年5 10月曾進(jìn)行了不同密度蝦夷馬糞海膽與仿刺參投餌混養(yǎng)的試驗(yàn) ,發(fā)現(xiàn)在靜水精養(yǎng)下混養(yǎng)時(shí)海膽的特定生長率(SGR) 和成活率比單養(yǎng)高 ,水質(zhì)穩(wěn)定 ,適宜密度為每立方米 44614 g。本研究采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，分析了由不同數(shù)目親本所產(chǎn)生的兩個(gè)中間球海膽群體的遺傳結(jié)構(gòu)，建立了稚膽材料的固定、DNA裂解及PCR技術(shù)，豐富了中間球海膽分子遺傳學(xué)研究內(nèi)容。表1 中間球海膽微衛(wèi)星擴(kuò)增反應(yīng)體系 The stock for mocrosatellite in sea urchin反應(yīng)體系需加體積海膽幼蟲裂解液 1ul10buffer 引物（10uM）dNTP (10 mM)Mg2+(25mM)Taq (5U/ul)ddH2OTotal25ul2. PCR反應(yīng)條件① 伸：72℃，1分鐘；⑤② 再將膠用純水沖洗一次。Hs為種群內(nèi)的基因多樣性。等位基因INST01A,INST02B,INST04C,INST10A,ST16B在P3群體中的頻率顯著高于P7群體中的頻率（P），而等位基因INST01B,INST02C,INST10C, INST14C,INST16C在P7群體中的頻率顯著高于P3群體中的頻率（P）。177。P3177。對(duì)于成體來說，往往組織量較大，因此可以在一定程度上彌補(bǔ)DNA在抽提過程中的丟失。一般認(rèn)為。本研究也發(fā)現(xiàn)親本數(shù)目較少的P3群體雖然等位基因數(shù)量與P7群體相同，但基因型數(shù)量少于