【正文】 二章 材料與方法.................................................. 3 實驗材料..................................................... 3 實驗方法..................................................... 3 DNA提取............................................... 3 PCR擴增................................................ 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析...............................................5第三章 實驗結(jié)果..................................................... 6 微衛(wèi)星擴增位點分析..........................................6 各位點等位基因情況..........................................7 遺傳多樣性分析...............................................9第四章 討 論...................................................... 10 海膽幼蟲DNA提取方法的優(yōu)勢...............................10 海膽遺傳學(xué)研究現(xiàn)狀......................................... 10致 謝................................................................12參考文獻............................................................. 13摘 要本實驗利用10對微衛(wèi)星引物，對由不同親本數(shù)目所產(chǎn)生的中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）群體進行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。177。177。s expected heterozygosis were 177。s expected heterozygosis were 177。微衛(wèi)星標(biāo)記是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種能有效區(qū)別不同物種、不同群體及不同基因型個體的分子標(biāo)記技術(shù)。李琪等[1]采用磁珠雜交選擇和 PCR篩選法,從長牡蠣DNA選擇片段文庫中 ,快速分離含有微衛(wèi)星序列的陽性克隆。尹紹武等[4]對海南近海點帶石斑魚野生和養(yǎng)殖群體微衛(wèi)星多態(tài)分析,總體上來看,點帶石斑魚野生群體的等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點比例等于養(yǎng)殖群體,而雜合度兩個群體相當(dāng),說明海南近海點帶石斑魚野生與養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源都較好,為保護海南近海點帶石斑魚的種質(zhì)資源提供了分子水平的依據(jù)。海膽市場價格很高 ,消費量卻非常大。結(jié)果表明，采用生殖調(diào)控可使不同海膽達到同步繁殖，在824℃下各種海膽雜交組合的受精率與親本親緣關(guān)系有關(guān)，同時受到雙親繁殖適宜溫度的影響,%之間。 常亞青等[20]曾利用 RAPD 技術(shù)對5種經(jīng)濟海膽基因組多態(tài)性進行了分析。結(jié)果表明, 10對引物共篩選出與殼徑、體質(zhì)量、生殖腺質(zhì)量顯著相關(guān)cDNAAFLP標(biāo)記數(shù)分別為448和42個；極顯著相關(guān)cDNAAFLP標(biāo)記數(shù)分別為338和23個。 DNA提取1. 將每只海膽分離開來，蒸餾水反復(fù)沖洗。 PCR擴增，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系見表1。 性：94℃，40秒；③延② 5TBE Buffer（2L）Tris 109gEDTA HBO3 超純水定容至2L③ 10%過硫酸銨10g過硫酸銨固體溶解于100ml超純水中，4℃避光保存。染色和顯色： ① 電泳結(jié)束后，將膠取下，用純水沖洗一次，染液（超純水）中染色10分鐘。微衛(wèi)星產(chǎn)物電泳結(jié)果經(jīng)肉眼觀察，將每個微衛(wèi)星位點的等位基因依據(jù)片斷大小分別命名為A、B、C、按照共顯性標(biāo)記進行基因型統(tǒng)計，帶型不清晰或多次擴增未見產(chǎn)物的個體用“..”表示。Ht為種群內(nèi)總的基因多樣性，計算公式為：n為位點總數(shù)，和分別為總的種群中I位點上的顯性頻率和隱性頻率。引物序列及相應(yīng)參數(shù)見表2。由表可以看出， 等位基因INST02C，ST16C在P7群體中出現(xiàn)（f=），而在P3群體中缺失，而INST04C在P3群體中出現(xiàn)（f=），而在P7群體中未被檢測到。10個位點在兩個群體中分別擴增出23個等位基因，177。%，177。177。177。177。該過程較繁瑣，且經(jīng)反復(fù)抽提，DNA損失量很大。微衛(wèi)星擴增結(jié)果說明該方法可以得到較好的幼蟲模板DNA，可以用于后續(xù)的分子標(biāo)記分析。通常，雜合度高的生物群體更容易適應(yīng)環(huán)境變化，忍受自然選擇壓力并可能具有更多的優(yōu)良經(jīng)濟性狀。本實驗所用海膽稚膽群體雜合度水平處于中等，但是用于產(chǎn)生這些個體的親本數(shù)均較少，推測將會存在不同程度的等位基因丟失、雜合度下降等的情況。Qin等[27]研究報道了海灣扇貝不同數(shù)目親本所產(chǎn)生的后代的遺傳結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)隨著親本數(shù)目的減少，出現(xiàn)了越來越嚴(yán)重的低頻位點丟失和雜合度下降的現(xiàn)象。致 謝本論文從選題的確定，論文的寫作、修改到最后定稿都是在指導(dǎo)老師秦副教授悉心指導(dǎo)下完成的。在此，謹(jǐn)向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x！感謝兩位師兄，感謝你們在實驗過程中對我的幫助，正是由于你們的幫助和支持，我才能克服一個一個的困難和疑惑，直至本文的順利完成！ 最后，衷心感謝在校學(xué)習(xí)期間所有老師對我的栽培、支持和鼓勵，感謝我深愛的父母和一直支持、幫助我的親戚朋友們！衷心地感謝在百忙之中參加此結(jié)題報告答辯的各位專家、教授！ 參考文獻[1] 李琪,(Crassostrea gigas)微衛(wèi)星克隆快速分離及特性分析[J].海洋湖沼,2004 ,4(35) :364 3691[2] 徐鵬