【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2504 2204 2375 2065 2129 1919 1719 2200 % % % % % % % % % 100% K1 K2 K3 6752 6644 5767 6311 6564 6288 5962 6193 7008 6072 6464 6627 k1 k2 k3 2251 2215 1922 2104 2188 2096 1987 2064 2336 2024 2155 2209 R 329 92 349 185 最佳配比 A1 B2 C3 D3 2536 % 試驗(yàn)結(jié)果 表明 最佳組合是 A1B2C3D3， 即淀粉 +葡萄糖濃度為 1+10%、 豆餅粉 %、玉米漿 %、硫酸銨 %。 四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的影響大小分別為 玉米漿 ＞ 淀粉 +葡萄糖 ＞ 硫酸銨 ＞ 豆餅粉 。玉米漿對(duì)試驗(yàn)的影響是主要的，其次 是 葡萄糖 和 淀粉。原因可能是因?yàn)橛衩诐{是一種容易被微生物利用的良好氮源，它富含豐富的氨基酸、還原糖、磷、微量元素和生長(zhǎng)素，且其中含有的磷酸 肌醇對(duì)促進(jìn)林可霉素的合成 有 積極作用。 由表 23 可以看出當(dāng)培養(yǎng)基為最佳配比 A1B2C3D3時(shí)其林可霉素產(chǎn)生量與對(duì)照組相比提高了 %。 加入的葡萄糖含量為 10%，說(shuō)明 10%葡萄糖濃度為菌體的生長(zhǎng)提供了豐富的碳源和能源，而沒(méi)有產(chǎn)生“葡萄糖效應(yīng)”。 在發(fā)酵過(guò)程中的 分別在 第 120h、 164h、 215h 左右取 上述 9 組的 發(fā)酵液， 考察了產(chǎn)物合成量，以進(jìn)一步分析其培養(yǎng)基的影響 。 李陽(yáng) 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 12 圖 22 不同時(shí)間 正交試驗(yàn) 測(cè)量 結(jié)果 線形圖 從 22圖中可以看出 2號(hào)瓶中加入的 量分別 為 淀粉 +葡萄糖（ 1+10%） 、 豆餅粉 %、玉米漿 %、 硫酸銨 %。 120h時(shí) 2號(hào)瓶所測(cè) 林可霉素 效價(jià)幾乎是最低的，這可能是葡萄糖含量較高的 原因 ，這可以從 1號(hào)和 3號(hào)中得到驗(yàn)證。從 120h到 164h 2號(hào) 瓶 效價(jià)能力增加的速度并不快，但從 164h到 215h 2 號(hào)效價(jià)能力增加的速度 卻 超過(guò)了其他各組，原因可能是 2號(hào)培養(yǎng)基適合菌體的生長(zhǎng)， 前期 時(shí) 菌體大量繁殖 ，使后期產(chǎn)生效價(jià)的速度加快 。 從前 3組中還可以看出隨著豆餅粉、玉米漿和硫酸銨含量的減少最終效價(jià)是逐漸提高的。 7號(hào)瓶中加入的 量分別為 淀粉 +葡萄糖（ 4+7%） ，豆餅粉 %，玉米漿 %，硫酸銨%。 在 120h測(cè)量的抗生素效價(jià)是 九組當(dāng)中是 最高的，與 9號(hào)以及前 3組 比較可以看出很可能是因?yàn)槠咸烟堑脑颉?7號(hào) 瓶 中葡萄糖加入量 為 7%是最少的，葡萄糖的量能促進(jìn)林肯鏈霉菌的生長(zhǎng)，但同時(shí)也表明葡萄糖很可能對(duì)林可霉素的合成有一定的抑制作用。而到 215h抗生素效價(jià)能力反而比 164h還要低，可能是培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，進(jìn)入衰亡期的時(shí)間提前， 產(chǎn)生的抗生素可能作為一種碳氮源而被利用了。 磷酸鹽的影響 磷是核酸和蛋白質(zhì)的必要組成成分，也是重要的能量傳遞者 三磷酸腺苷的成分，在代謝途徑的調(diào)節(jié)方面，磷起著重要的作用?？股厣锖铣芍辛姿猁}調(diào)節(jié)最重要的有三種機(jī)制：磷酸鹽對(duì)初級(jí)代謝的刺激，菌體內(nèi) ATP迅速增加，并使糖分解從單磷酸己糖途徑轉(zhuǎn)變成糖酵解途徑，菌體趨向于生長(zhǎng)；磷酸鹽限制抗生素合成途徑中前體物質(zhì)的生成，從而限制抗生素產(chǎn)物的啟動(dòng)合成 [17]；磷酸鹽可抑制抗生素的磷酸化前體的代謝有關(guān)的磷酸酯酶的作用等。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同的磷酸二氫鉀濃度 （其他發(fā)酵培養(yǎng)基中物質(zhì)的量參照 ） ，對(duì)發(fā)酵效價(jià)進(jìn)行了考察。 表 24 磷酸二氫鉀 對(duì)產(chǎn)生林可霉素的影響 結(jié)果 0 500 1000 1500 2022 2500 3000 120h 164h 215h 1 號(hào) 2 號(hào) 3 號(hào) 4 號(hào) 5 號(hào) 6 號(hào) 7 號(hào) 8 號(hào) 9 號(hào) 效價(jià) (U/mL) 時(shí)間 (h) 安徽學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) （ 論文 ） 13 磷酸二氫鉀含量 0 % % % % % 效價(jià) (U/mL) 1556 2134 2373 2520 2212 1653 圖 23 磷酸二氫鉀對(duì) 產(chǎn)生 林可霉素的影響 結(jié)果柱形圖 從圖 23可以看 出 隨著 磷酸二氫鉀 濃度的增加 其產(chǎn)生的林可霉素 效價(jià)也在提高 ， 試驗(yàn)表明當(dāng)磷酸鹽的濃度達(dá)到 %時(shí)其產(chǎn)生的 林可霉素 效價(jià)是最高的。比 0號(hào) 瓶 （沒(méi)有加磷酸鹽）的效價(jià)高了 62%。 在小于 %或等于這個(gè)濃度時(shí)磷酸 鹽對(duì)林肯鏈霉菌的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用， 說(shuō)明產(chǎn)生林可霉素時(shí)磷酸鹽的存在 不會(huì)影響到林可霉素的合成。而當(dāng)濃度大 于 %時(shí)磷酸鹽對(duì)林可霉素的合成使有很強(qiáng)的抑制作用， 這可能是 當(dāng)菌體到合成抗生素 時(shí)磷酸鹽仍然存在，直到磷酸鹽消耗完才開(kāi)始合成林可霉素，這就推遲了林可霉素合成的時(shí)間。有實(shí)驗(yàn)表明林可霉素的產(chǎn)生幾乎都是在磷酸鹽消耗完以后才開(kāi)始的 [18]。 的影響 林可霉素屬于糖類抗生素，由一氨基酸組分（脯氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，酪氨酸的衍生物：丙基脯氨酸）和一糖組分（甲硫林可糖胺）構(gòu)成 [19]。氨基酸部分是由莽草酸 先合成酪氨酸，最后轉(zhuǎn)化為丙基脯氨酸，所以酪氨酸是產(chǎn)物合成的前體物質(zhì) 之一，對(duì)林可霉素的產(chǎn)生有促進(jìn)作用 。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同的 酪氨酸 濃度 （發(fā)酵培養(yǎng)基中物質(zhì)的量參照 和正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果） ，初步考察了酪氨酸濃度對(duì)林可霉素的產(chǎn)生和影響 。 表 35 前體酪氨酸 對(duì)產(chǎn)生林可霉素的影響 測(cè)量結(jié)果 酪氨酸含量 0 % % % % 效價(jià) (U/mL) 2500 2057 2805 2872 2532 0 500 1000 1500 2022 2500 3000 0 磷酸二氫鉀量 （ %） 林可霉素含量 （ U/mL） 李陽(yáng) 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 14 圖 24 前體酪氨酸 對(duì)產(chǎn)生林可霉素影 響的柱形圖 圖 24表明 總體來(lái)說(shuō) 前體酪氨酸 的加入對(duì) 產(chǎn)生林可霉素 效價(jià)的大小 是有促進(jìn)作用的 ,酪氨酸 是林可霉素前體的一種，他 的加入 相當(dāng)于添加 了一種誘導(dǎo)劑，他可能解開(kāi)了阻礙次級(jí)反應(yīng)的抑制物，使林肯鏈霉菌過(guò)早進(jìn)行林可霉素的合成。 所以有酪氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基比沒(méi)有酪氨 酸的發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)生的效價(jià)要高， 當(dāng) 加入的酪氨酸濃度達(dá)到 %時(shí)比沒(méi)加的效價(jià)提高了大約 %。 一般向林肯鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入前體物質(zhì)的話都會(huì)使產(chǎn)生林可霉素增加的。但 試驗(yàn)表明能對(duì)次級(jí)代謝途徑產(chǎn)生促進(jìn)作用的一般都會(huì)對(duì)初級(jí)代謝途徑產(chǎn)生抑制作用[20]。 所以當(dāng)酪氨酸濃度過(guò)高時(shí)產(chǎn)生林可霉素的能力便會(huì)下降。 0 500 1000 1500 2022 2500 3000 3500 0 林可霉素含量 （ U/mL） 酪氨酸含量 （ %） 安徽學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) （ 論文 ） 15 結(jié)論與 展望 結(jié)論 ： 通過(guò)試驗(yàn)可以看出在正交試驗(yàn)四個(gè)因素當(dāng)中，對(duì)林可霉素的產(chǎn)生影響是不同的，其中玉米漿影 響最大 ，各因素的主次順序?yàn)?C＞ A＞ D＞ B，即玉米漿 葡萄糖 硫酸氨 豆餅粉。 根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù) 最佳 配比關(guān)系是 A1B2C3D3，即淀粉 +葡萄糖濃度為 1+10%、豆餅粉%、玉米漿 %、硫酸銨 %時(shí)， 產(chǎn)生的效價(jià)能力是最高的 ，與對(duì)照組相比提高了%。 1． 碳 氮 源對(duì)產(chǎn)生林可霉素的影響 碳源是發(fā)酵過(guò)程中合成菌體及抗生素的能量和碳素來(lái)源 。 本試驗(yàn)中加入的碳源是葡萄糖和淀粉。 葡萄糖是 速效碳源，在微生物生長(zhǎng) 繁殖 時(shí)最易被利用 ，但濃度過(guò)高 時(shí) 會(huì)產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)，對(duì)抗生素的生物合成具有抑制作用。 試驗(yàn) 結(jié)果 表明當(dāng) 葡萄糖濃度 達(dá)到 10%時(shí)仍對(duì)微生物有 較好 促進(jìn)作用。但葡萄糖濃度 過(guò)低時(shí)對(duì)菌體 的生長(zhǎng)顯然 是 不利。 氮源是用來(lái)構(gòu)成菌體的蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)以及抗生素等含氮代謝產(chǎn)物的。 本試驗(yàn)加入了兩種氮源：豆餅粉和硫酸氨， 結(jié)果 表明豆餅粉對(duì)試驗(yàn)的影響是很小的 ， 可以作為試驗(yàn)的誤差分析。氮源類主要影響試驗(yàn)的是硫酸氨， 但濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生氨阻遏效應(yīng)，影響抗生素的生物合成。 從試驗(yàn)結(jié)果我 們可以看出最佳配比的硫酸氨濃度是 %。說(shuō)明當(dāng)濃度為 %時(shí)可能 已經(jīng)對(duì)林可霉素的產(chǎn)生有阻遏作用。 2． 無(wú)機(jī)鹽磷酸二氫鉀對(duì)產(chǎn)生林可霉素的影響 磷是核酸和蛋白質(zhì)的必要組成成分，也是重要的能量傳遞者 三磷酸腺苷的成分，在代謝途徑的調(diào)節(jié)方面，磷起著重要的作用。 試驗(yàn)表明當(dāng)磷酸鹽的濃度 為 %時(shí)在產(chǎn)生的效價(jià)是 比較 高的 ， 達(dá)到 了 2520U/mL，比沒(méi)有加磷酸鹽的效價(jià)提高了 62%。 但由于磷酸鹽對(duì)林肯鏈霉菌產(chǎn)生林可霉素的次級(jí)代謝途徑有阻礙作用，所以當(dāng)濃度大于 %時(shí)便會(huì)延遲或減少林可霉素的合成 。 3． 酪氨酸前體對(duì) 產(chǎn)生林可霉素的影響 試驗(yàn)表明當(dāng) 發(fā)酵培養(yǎng)基 中加入酪氨酸時(shí)其效價(jià)能力比原來(lái)要高，當(dāng) 加入的酪氨酸濃度達(dá)到 %時(shí)其 效價(jià) 能力 提高了大約 %，但估計(jì)酪氨酸的加入并不是提高了林可霉素產(chǎn)生速率，只是加入的酪氨酸提前了產(chǎn)生林可霉素的時(shí)間。 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)合成 林可霉素 的影響主要 在林肯鏈霉菌的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝上 ，往往有些對(duì)初級(jí)代謝起生長(zhǎng)促進(jìn)作用 物質(zhì)反而 對(duì)次級(jí)代謝反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用 ，相反 有些則可能 對(duì)產(chǎn)生林可霉素的次級(jí)反應(yīng)起促進(jìn)作用而對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制，所以 我們必須找出這些物質(zhì)的關(guān)系， 在 保證 林肯鏈霉 菌充分生長(zhǎng) 繁殖 的基礎(chǔ)上及時(shí)啟動(dòng)對(duì)林可霉素產(chǎn)生的 次 級(jí) 代謝 反應(yīng) ，這就是試驗(yàn)的目的。 展望 ： 最近幾年來(lái)，我國(guó)在林可霉素醫(yī)療效果上發(fā)展迅速，產(chǎn)量不斷增大，技術(shù)水平也不斷提高。國(guó)外在經(jīng)過(guò)近 幾 十年的發(fā)展后，林可霉素的發(fā)酵水平尤其是美國(guó)其發(fā)酵單位已達(dá)到 23萬(wàn) U/mL。國(guó)內(nèi)起步比較晚 ，起步效價(jià)很低，目前國(guó)內(nèi)發(fā)酵水平仍然不高。 與國(guó)外的生產(chǎn)水平相比仍有很大的差距 。因此研究林可霉素發(fā)酵工藝提高生產(chǎn)水平， 無(wú)論對(duì)醫(yī)療還是在與國(guó)外的競(jìng)爭(zhēng)上都具有很重要的意義。 本試驗(yàn)也著重于培養(yǎng)基的優(yōu)化上，但與前人所選取的因素不同，以淀粉 +葡萄糖、豆餅粉、玉米漿和硫酸銨四個(gè)因素做正交試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上選出最佳的配比關(guān)系 ,確定李陽(yáng) 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 16 他們合成林可霉素影響的大小 ， 這對(duì)以后的工作有很大幫助 。試驗(yàn)還選取了酪氨酸前體做 單因素試驗(yàn)，這在國(guó)內(nèi)是不多的。但這次試驗(yàn)還有很多不足之處 ，如由于時(shí)間的原因，本試驗(yàn)對(duì)很多物質(zhì)的單因素試驗(yàn)沒(méi)有過(guò)多的設(shè)及，如能對(duì)培養(yǎng)基中的各種物質(zhì)做進(jìn)一步的單因素分析，并深層探過(guò)這些物質(zhì)對(duì)產(chǎn)生林可霉素的調(diào)控機(jī)制。將會(huì)對(duì)以后的試驗(yàn)和工業(yè)生產(chǎn)有很大的 幫助 。 但目前 國(guó)內(nèi) 的研究重點(diǎn) 主要是在林可霉素的誘變、篩選以及發(fā)酵工藝的條件優(yōu)化上 ,而國(guó)際上主要側(cè)重于合成林可霉素的 基因研究，他們探討的是微生物的基因那些是控制生長(zhǎng)的那些是控制合成林可霉素的，而這些相應(yīng)的基因又是如何調(diào)節(jié)。將來(lái)國(guó)內(nèi)研究的重點(diǎn)也會(huì)轉(zhuǎn)到 林肯鏈霉菌生長(zhǎng)發(fā)酵的 基因 上 ，只有在掌握了 生長(zhǎng) 發(fā)酵的本質(zhì)，我們便可以在基因的水平上通過(guò)定點(diǎn)突變大幅度提高 產(chǎn)抗生素 效價(jià)能力。