【文章內(nèi)容簡介】 GCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站比對，結(jié)果如表17。 表17 琯溪蜜柚果實PSY基因測序結(jié)果比對AccessionDescriptionMax scoreTotal scoreQuery coverageMaxidentgi|166343817|Citrus maxima phytoene synthase mRNA, plete cds24422442100%98%gi|82394886|Citrus sinensis phytoene synthase mRNA, plete cds23962396100%98%gi|6959859|Citrus unshiu phytoene synthase (Psy1) mRNA, plete cds23962396100%98%gi|11344506|Citrus unshiu mRNA for phytoene synthase, plete cds23962396100%98%gi|166343815|X Citrofortunella mitis phytoene synthase mRNA, plete cds23842384100%98%gi|13542331|Citrus x paradisi phytoene synthase mRNA, plete cds23792379100%98%注：Citrus maxima：文旦；Citrus sinensis：甜橙；Citrus unshiu：溫州蜜柑；Citrofortunella mitis：四季橘；Citrus paradisi：葡萄柚通過比對可發(fā)現(xiàn)：①與柑桔屬PSY基因同源性都較高，其中與柚PSY基因（No. 166343817）同源性最高；②與柚PSY基因（No. 166343817）比對發(fā)現(xiàn)：有一個TAA的gap存在；8個堿基不匹配。此外，我們還將紅肉蜜柚突變體與野生型琯溪蜜柚果實PSY基因DNA序列和氨基酸序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)在1317 bp的編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn)11個差異位點，439個氨基酸序列中有7個差異位點，出現(xiàn)差異位點表18，19：表18 紅肉蜜柚和琯溪蜜柚PSY基因序列不一致情況分析樣品名稱堿基位點248352455613904969975994105410681236紅肉蜜柚AGAGAAGGTGA琯溪蜜柚GAGAGTATCAG表19 紅肉蜜柚和琯溪蜜柚PSY基因合成的氨基酸序列不一致情況分析樣品名稱氨基酸位點83118152205302332352紅肉蜜柚GNGRGZL琯溪蜜柚DDEGRQF5 討論類胡蘿卜素是生物體內(nèi)通過類異戊二烯途徑合成而呈現(xiàn)黃色、橙紅色和紅色的一大類帖類色素物質(zhì)，類異戊二烯是自然界中分布廣泛的一類化合物，目前已知的類異戊二烯化合物有23000多種。所有的光合生物以及許多非光合細菌和真菌均可以在體內(nèi)合成類胡蘿卜素。類胡蘿卜素是其中較為重要的植物色素，不僅參與光合作用和光保護，還賦予根、葉、花和果實等多彩的顏色，使之具有較大的經(jīng)濟價值和觀賞價值。除此之外，類胡蘿卜素中一些代謝中間產(chǎn)物還具有較高的營養(yǎng)和保健價值，如番茄紅素能預防心臟病和多種癌癥、減緩動脈粥樣硬化、保護心血管、抗老化、保護皮膚等；b胡蘿卜素是維生素A原，維生素A缺乏會引起夜盲癥等多種疾病的發(fā)生。近年來，包括番茄紅素和b胡蘿卜素在內(nèi)的植物類胡蘿卜素代謝途徑的主要成員、關鍵酶及其基因已基本明確[13~16]。應用類胡蘿卜素合成途徑中相關基因的轉(zhuǎn)基因研究也取得了較大進展，“黃金稻米”就是最成功的例子[17]。例如，Ye等[18]與Romer等[19]分別向水稻和番茄中導入類胡蘿卜素合成途徑相關基因，并未獲得預期中高水平的番茄紅素積累，卻導致靶器官中b胡蘿卜素含量增加。由此可見，為減少類胡蘿卜素遺傳工程中的盲目性，闡明植物體內(nèi)類胡蘿卜素代謝相關基因表達調(diào)控機制十分必要。現(xiàn)有研究表明，類紅蘿卜素合成途徑可包括上游（八氫番茄紅素的合成）和下游（類胡蘿卜素種類間的轉(zhuǎn)化）途徑。研究還表明下有途徑的調(diào)控通常只能影響類胡蘿卜素組成而對總含量影響較小。幾乎所有高等植物類胡蘿卜素合成主鏈途徑均相同，柑桔類也不例外。類胡蘿卜素上游合成途徑需要十種酶參與，其活性的高低直接決定了果實類胡蘿卜素的含量。在番茄等模式植物上的研究表明，在上述十種酶中以DXPS和PSY最為關鍵[20~22]。本研究根據(jù)GenBank中報道的植物類胡蘿卜素代謝相關酶基因序列，分離了紅肉蜜柚及其親本琯溪蜜柚果實PSY基因(八氫番茄紅素合成酶基因)。它是催化類胡蘿卜素生物合成的一個特異性酶，可以將2分子的磷酸(GGPP)催化合成第一個類胡蘿卜素——八氫番茄紅素。八氫番茄紅素合成類胡蘿卜素的重要前體，類胡蘿卜素是維生素A重要的前體之一。研究表明八氫番茄紅素合成酶基因是類胡蘿卜素生物合成途徑中的限速酶。在PSY催化下，八氫番茄紅素進一步脫氫生成番茄紅素。在番茄、油菜、擬南芥和馬鈴薯中過量表達八氫番茄紅素合成酶，相應組織中積累類胡蘿卜素的水平顯著提高，擬南芥種子中b胡蘿卜素平均提高43倍，油菜種子中提高50倍，馬鈴薯塊莖中提高了8倍。目前國外有研究將PSY基因轉(zhuǎn)入到水稻中，在其胚乳組織中表達并合成了類胡蘿卜素，而且比較了不同的物種來源的八氫番茄紅素合成酶基因?qū)λ九呷榻M織中合成的類胡蘿卜素含量[17]。八氫番茄紅素合成酶基因是重要的色素酶基因，存在于所有進行光合作用的高等植物中。因此，構(gòu)建相應的八氫番茄紅素合成酶基因真核表達載體，并引入到其他蔬菜水果食用組織特異性啟動子，為其合成酶基因提供物質(zhì)基礎，提高其食用部分的八氫番茄紅素的表達水平，為在真核生物鐘合成類胡蘿卜素奠定堅實基礎。本研究選用的材料是琯溪蜜柚及其突變體紅肉蜜柚，兩者親緣關系相近，不存在種間、近緣屬間差異。與野生型相比，突變體果實表型變化非常明顯，含豐富的番茄紅素和b胡蘿卜素。類胡蘿卜素代謝中間產(chǎn)物番茄紅素和b胡蘿卜素具有較高的營養(yǎng)價值，但在常見的果實中，番茄紅素和b胡蘿卜素含量很低；有的含量雖高，但又常常積累在非食用部位。紅肉蜜柚和琯溪蜜柚相比，果肉部分大量積累番茄紅素和b胡蘿卜素。因此，對這一現(xiàn)象內(nèi)在機理的揭示，將為品種改良及分子育種提供理論基礎，具有非常誘人的應用前景。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點，容易受RNA酶的攻擊反應而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定（能耐高溫、耐酸、耐堿，高壓滅菌處理也不能使其完全失活）且廣泛存在，因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染，并設法抑制其活性，這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中180 ℃烘烤2 h以上。 %的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。DEPC是強RNase抑制劑，它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性。試驗所用試劑也可用DEPC處理， %濃度，然后37 ℃過夜處理，再煮沸15 min或高壓滅菌以消除殘存的DEPC，否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。DEPC能與胺和巰基反應，因而含Tris的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外，也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等。實驗中使用的槍頭、EP管、 %的DEPC處理，耐高溫的玻璃器皿等要在65 ℃烘烤4 h以上。內(nèi)源的RNase一般利用蛋白質(zhì)變性劑除去，如苯酚、氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸鈉等。RNA的提取的大體步驟：破壞細胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去鹽離子。由于RNA的種類來源和存在形式不同，所用的制備方法各異，一般常用的方法有，熱酚法[24]，Trizol法[25]和異硫氰酸胍法[26~27]等。但是高等植物，尤其是木本植物組織內(nèi)含有較多的多糖和酚類物質(zhì)，使用上述方法很難去除。本實驗的實驗材料是成熟紅肉蜜柚和琯溪蜜柚的果肉，兩者果肉組織都有大量的多糖類物質(zhì)存在，使RNA成凝膠狀，且難于溶解。即使加熱溶解，酚類和多糖的干擾也抑制了后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄以及PCR反應[13]。所以要從柑橘類成熟果實果肉中提取高質(zhì)量的RNA的關鍵之處在于既去除多糖等雜質(zhì)又盡可能地回收RNA。本研究提取果肉總RNA所采用的方法是改良Bugos法。其中LiCl的作用是在一定pH下是RNA特異性的沉淀下來，進一步把核酸中的DNA和RNA進行分離，去除DNA污染[23]。改良Bugos法可提取柑橘多種組織及成熟果實果肉中的RNA，且所得RNA質(zhì)量較高，成為柑橘組織RNA提取方法的首選[11]。但是，采用改良Bugos法提取所得RNA仍存在一定DNA的污染，因而進行其它操作之前進行再次LiCl沉淀以進一步去除DNA。提取高質(zhì)量、高產(chǎn)量的RNA是RTPCR的必要前提。細胞內(nèi)大部份RNA均與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分離制備RNA時，首先遇到的是必須使RNA與蛋白解離，并除去蛋白質(zhì)。本研究以紅肉蜜柚和琯溪蜜柚成熟果實cDNA為模板，利用PCR技術克隆了八氫番茄紅素合成酶（PSY）基因片段，擴增產(chǎn)物連接到pUCmT載體中。對紅肉蜜柚突變體和琯溪蜜柚果實PSY基因測序發(fā)現(xiàn)：紅肉蜜柚突變體和琯溪蜜柚與柑桔屬PSY基因同源性都相對較高，與柑桔屬PSY基因同源性都較高；兩者 PSY序列進行對比，發(fā)現(xiàn)有11個堿基存在差異；紅肉蜜柚突變體及其野生型琯溪蜜柚果實PSY基因氨基酸序列進行比對，也有7個氨基酸的差異，表明紅肉蜜柚突變體的PSY基因只是出現(xiàn)錯配，沒有出現(xiàn)丟失和移碼等突變。但這些位點的突變是否引起PSY基因表達水平的改變，進而影響紅肉蜜柚果肉高水平積累番茄紅素和b胡蘿卜素，仍有待于進一步的研究分析。參考文獻[1] 張敏, 鄧秀新. 柑橘芽變選種以及芽變性狀形成機理研究進展[J]. 果樹學報, 2006, 23(3):871~876.[2] 黃新忠, 陸修閔, 陳曉明等. 紅肉蜜柚與琯溪蜜柚親緣關系初探[J]. 亞熱帶植物科學, 2006, 35(4): 28~35.[3] 鄧定紅. 琯溪蜜柚的換代品種紅肉蜜柚[J]. 農(nóng)村新技術, 2007,24(2): 27.[4] Bartley ., Scolnik P. 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