蛋白質及氨基酸的測定(編輯修改稿)
2025-05-29 05:28 本頁面
【文章內容簡介】 60mg、 70mg、 80mg、 90mg、 100mg、110mg分別稱取混合均勻的標準蛋白質樣于 8支 50mL納氏比色管中，然后各加上 1mL四氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液準確稀釋至50mL，振搖 10min，靜置 1h，取上層清液離心 5min，取離心后的透明液于比色皿中，在 560nm波長下以蒸餾水作參比液調節(jié)儀器零點并測定各溶液的吸光度值 A。以蛋白質的含量為橫坐標，吸光度值 A為縱坐標繪制標準曲線 準確稱取適量樣品（即使得蛋白質含量在 40110mg之間）于 50mL納氏比色管中，加 1ml四氯化碳，按上述步驟顯色后，在相同條件下測其吸光度值 A。用測得的 A值在標準曲線上即可查得蛋白質毫克數(shù)，進而由此求得樣品中的蛋白質含量。 結果計算： ? 式中 C—— 由標準曲線上查的的蛋白質含量， mg ? M—— 樣品質量， g 說明： ? 不同種類的蛋白質，對發(fā)色程度的影響不大 ? 含脂肪量高的樣品應先進行脫脂處理 ? 若樣品中含有不溶性成分時，會對比色帶來困難，此時可預先將蛋白質抽出后在進行測定 ? 類脂、色素等要干擾比色，測定時注意消除干擾。 ?讀數(shù)時要注意讀的是 A的值； ?注意正確標記試管（用記號筆清晰標記于試管 2/3高處）； ?準確記時。 注意事項 ? 蛋白質及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)殘基在紫外區(qū)對280nm波長的光具有選擇吸收作用。在此波長下，光吸收程度與蛋白質濃度（ 38mg/mL）成線性關系。因此，通過測定蛋白質溶液的吸光度，可求出樣品蛋白質含量。 紫外分光光度計法 ? 紫外分光光度計 ? 離心機（ 30005000r/min） 所需試劑 ?95%乙醇 ?無水乙醚 ??8mol/L尿素的 2mol/L氫氧化鈉溶液 繪制標準曲線 ? 準備稱取樣品 50ml燒杯中，加入，不斷攪拌 10min鐘使其充分溶解，使四層紗布過濾于玻璃離心管中，以3000~5000r/min的速度離心 5~10min，傾出上清液。 ?分別吸取 、 、 、 、 10mL容量瓶中，各加入 8mol/L尿素的 2mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度，充分震搖 2min,若渾濁，再次離心至透明為止。 準確稱取試樣 ,處理后使其蛋白質濃度為 3~8mg/L，然后按 ?的步驟測定其吸光度，再從標準曲線中查出蛋白質的含量。 ③ .將透明液置于比色皿中，以 8mol/L尿素的2mol/L氫氧化鈉溶液作參比液，在 280nm波長處測定各溶液的吸光度值 A。以凱式定氮法測得樣品中蛋白質的質量為橫坐標，上述吸光度值 A為縱坐標，繪制標準曲線。 ?? 本法操作簡單迅速，適用于測定小麥面粉，糕點，豆類，蛋黃，及肉制品中蛋白質的含量。 ? 溫度對蛋白質水解有影響，操作溫度應該控制在2030攝氏度之間。 ? 本法由于許多非蛋白質成分在紫外光區(qū)有吸收作用，加之光散射作用的干擾，故在食品分析領域中的應用并不廣泛。 蛋白質或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物），藍色的深淺與蛋白質的含量成正比，可用比色法測定。 實驗原理 吸取一定量的樣品稀釋液，加入福林酚試劑甲 ，置于 25℃ 中水浴保溫 10min，再加入福利 酚試劑乙 ，立即混勻，保溫30min，以介質溶液調零，于 750nm波長下測定溶液的吸光度 A，與蛋白質標準液作對照，求出樣品的蛋白質含量。 本法在 0~60mg/L蛋白質范圍內呈良好的線性關系。 福林 酚法的靈敏度比雙縮脲法高 100倍，肽鍵顯色效果增強，減少了因蛋白質種類引起的偏差。 該法由于兩步呈色反應可以疊加，其靈敏度特別 高，所以適用于 20~250ug微量蛋白質的測定，可檢測的最低蛋白質量為 福林 酚法試劑配置繁瑣耗時 。 酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定，由于此實驗的反應只在 PH=10時才發(fā)生，所以加酚試劑時必須立即混勻，以便在磷鉬酸 磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應，否則會使顯色程度減弱。 說明：
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