蛋白質(zhì)及氨基酸的測定(完整版)
【正文】 溶液進行滴定。它是測定總有機氮的最準確和操作較簡便的方法之一，應(yīng)用廣泛。凡是有生命的物體，無論是動植物還是微生物，都還有蛋白質(zhì)。 ? 測定食物中蛋白質(zhì)含量的方法有多種，一般可分為間接方法和直接方法。 凱氏定氮法 常量凱氏定氮法 微量凱氏定氮法 半微量凱氏定氮法 自動定氮儀法 常量凱氏定氮法 ? 適用范圍 ：適用于各類食品中蛋白質(zhì)含量的測定，也是測定蛋白質(zhì)含量的國家標準分析方法。 標準鹽酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液 ? 為了加速反應(yīng)進行，我們常需加入一定量加速劑。 ? 注意：加入量不能過大，溫度過高會引起已生成的銨鹽分解釋放出氨而造成損失。如無氨生成，即可停止加熱。 同常量凱式定氮法 注意事項 水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝無氮蒸餾水至 2/3容積處。 ? 在一定的濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。因此，通過測定蛋白質(zhì)溶液的吸光度，可求出樣品蛋白質(zhì)含量。 ? 本法由于許多非蛋白質(zhì)成分在紫外光區(qū)有吸收作用，加之光散射作用的干擾，故在食品分析領(lǐng)域中的應(yīng)用并不廣泛。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。 ? 考馬斯亮藍染色法的突出優(yōu)點是： ? (1)靈敏度高 ，據(jù)估計比 Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達 1 mg。 (3)干擾素物質(zhì)少 。 試劑 40%中性甲醛溶液（用百里酚酞作指示劑，用 NaOH將 40%甲醛中和至淡藍色） %百里酚酞乙醇溶液 測定 吸取待測液 50mL于 250mL錐形瓶中，加 %百里酚酞指示劑 2~3滴 用 色，再加 40%中性甲醛溶液 20mL 搖勻靜止 1min,繼續(xù)用 標準溶液滴定至淡藍色，記錄第二次滴定所消耗的 NaOH溶液的體積 V. 雙指示劑甲醛滴定法 ⑴原理 氨基酸具有酸性的 — COOH基和堿性的 — NH2基。分別記錄兩次所消耗的堿液體（ mL）。該藍紫色化合物的深淺與氨基酸含量成正比，在波長 570nm處有最大吸收峰，故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量 ?儀器 ?可見分光光度計 ? 2%茚三銅溶液 ? pH為 ? 氨基酸標準溶液 操作方法 標準曲線的繪制 準確吸取 200ug/ml的氨基酸標準溶液 、 、 ，分別置于 25ml比色管中，個加水至容積為 ，然后加入 2%茚三銅溶液和 pH為 緩沖液各 1ml，混合均勻后于水浴上加熱 15min，取出迅速冷至室溫，定容，搖勻。 每個樣品測定之前要用蒸餾水洗滌儀器 23次 謝謝 。以氨基酸的微克數(shù)為橫坐標，吸光度 A值為縱坐標，繪制標準曲線 。 1 0 00 1 )( 12 ????? m cVVX電位滴定法 (1) 原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標準溶液滴定，依據(jù)酸度計指示的 pH值判斷和控制滴定終點。當加入甲醛溶液時， —NH2與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。 ?注意事項 ? 在試劑加入后的 520 min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。 ? (2)測定快速、簡便，只需加一種試劑 。 ? 考馬斯亮蘭 G250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰 (lmax)的位置，由 465 nm變?yōu)? 595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色。 實驗原理 吸取一定量的樣品稀釋液，加入福林酚試劑甲 ，置于 25℃ 中水浴保溫 10min，再加入福利 酚試劑乙 ，立即混勻，保溫30min，以介質(zhì)溶液調(diào)零，于 750nm波長下測定溶液的吸光度 A，與蛋白質(zhì)標準液作對照，求出樣品的蛋白質(zhì)含量。 ?分別吸取 、 、 、 、 10mL容量瓶中，各加入 8mol/L尿素的 2mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度，充分震搖 2min,若渾濁，再次離
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