蛋白質(zhì)及氨基酸的測定(已修改)
2025-05-14 05:28 本頁面
【正文】 生物技術(shù)第三組 ? 蛋白質(zhì)存在于一切生物的原生質(zhì)中，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。凡是有生命的物體，無論是動(dòng)植物還是微生物，都還有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)與營養(yǎng)代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、激素、病毒、免疫、物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)和遺傳等密切相關(guān)，缺乏蛋白質(zhì)生物就不能維持生命。人及動(dòng)物只能從食物中得到蛋白質(zhì) 及其分解代謝產(chǎn)物來構(gòu)成自身蛋白質(zhì)，故蛋白質(zhì)是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是食品中重要的營養(yǎng)成分 。 ? 蛋白質(zhì)是由多種氨基酸結(jié)合而成的復(fù)雜的高分子化合物。其中含有的主要化學(xué)元素為碳、氫、氧、氮等，大多數(shù)蛋白質(zhì)還含有硫，某些蛋白質(zhì)中還含有微量的磷、銅、鐵、碘、鋅等元素，但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)分其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。 ? 測定食物中蛋白質(zhì)含量的方法有多種，一般可分為間接方法和直接方法。 ? 間接方法是通過測定樣品中蛋白質(zhì)的總氮量，再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)含量 ? 直接方法是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，直接測定蛋白質(zhì)含量的方法。 ? 測定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法。它是測定總有機(jī)氮的最準(zhǔn)確和操作較簡便的方法之一，應(yīng)用廣泛。此外，雙縮脲法、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán) G250法、福林 酚法等也常用于蛋白質(zhì)含量測定。 ?凱氏定氮法 ?雙縮脲法 ?紫外分光光度法 ?福林 酚比色法 ?考馬斯亮藍(lán)染料比色法 ? 由 19世紀(jì)丹麥化學(xué)家 Kieldahl首先提出。 ? 它是測定蛋白質(zhì) 最常用的方法 ，也是測定總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和操作簡單的方法之一。 ? 適用范圍：此法 只限于測定總氮量 ，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，可得蛋白質(zhì)含量，由于樣品中常含有非蛋白質(zhì)的含氮化合物，因此常將測定的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。 凱氏定氮法 常量凱氏定氮法 微量凱氏定氮法 半微量凱氏定氮法 自動(dòng)定氮儀法 常量凱氏定氮法 ? 適用范圍 ：適用于各類食品中蛋白質(zhì)含量的測定，也是測定蛋白質(zhì)含量的國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。 ? 一 原理： ? 有機(jī)含氮化合物與濃硫酸和催化劑共熱消化，氮轉(zhuǎn)化為氨，再與硫酸結(jié)合成硫酸銨。硫酸銨與強(qiáng)堿反應(yīng)，放出氨。將氨蒸餾到過量的標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)溶液中，再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行滴定。根據(jù)測得的氨量，計(jì)算樣品的總氮量 。 濃硫酸對含氮有機(jī)物的消化作用主要是氧化還原作用，使有機(jī)物碳化的同時(shí)在高溫下又有強(qiáng)氧化性，能將有機(jī)物氧化分解成水和二氧化碳，使氮還原為氨，氨與硫酸作用生成硫酸銨留在溶液中。 在消化完全的樣品中加入濃氫氧化鈉溶液，加熱蒸餾，生成氣態(tài)氨。 用硼酸吸收蒸餾所放出的氨氣。 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液 ? 為了加速反應(yīng)進(jìn)行，我們常需加入一定量加速劑。按其效果不同可分為：增溫劑、催化劑和氧化劑。 ? 當(dāng)溫度低于 360176。 C時(shí)，消化不完全，尤其是雜環(huán)氮化物，會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果偏低。當(dāng)溫度高于 410 176。 C時(shí)，銨鹽就會(huì)分解，故消化溫度最好控制在二者之間。 ? 純 硫酸的沸點(diǎn)是 340 176。 C附近，因其溫度達(dá)不到最適，則 需要添加增溫劑，常用的增溫劑有：硫酸鉀，硫酸鈉，主要原因是消化過程中硫酸不斷被分解，水分不斷逸出使硫酸濃度增大。 ? 注意：加入量不能過大，溫度過高會(huì)引起已生成的銨鹽分解釋放出氨而造成損失。 ? 其種類繁多，最常用的是硫酸銅。催化劑能降低反應(yīng)所需的能量，除此之外硫酸銅還可指示消化終點(diǎn)的到達(dá)和下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。 ? 由于氧化劑反應(yīng)過于激烈，若使用不當(dāng)易造成氮損失結(jié)果不穩(wěn)定，常需嚴(yán)格控制它的用量和次數(shù)。 ? 常用的有：高氯酸，過氧化氫 A、凱氏燒瓶 規(guī)格： 50ml、 100ml、 250ml、 500ml、 1000ml 特點(diǎn)：瓶頸長、耐高溫 B、常量凱氏定氮裝置 ? 濃硫酸 ? 硫酸銅 ? 硫酸鉀 ? 4%硼酸溶液 ? 甲基紅 溴甲酚綠混合指示劑： 五份 %溴甲酚綠、 95%乙醇溶液、一份 %甲基紅乙醇溶液均勻混合 ? 4
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