蛋白質(zhì)及氨基酸的測定-預(yù)覽頁
【正文】 ? 三、滴定 將上述吸收液用 定至由藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色即為終點，記錄鹽酸溶液用量，同時作一試劑空白，記錄空白試驗消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積。 蒸餾結(jié)束 ：蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色開始計時，繼續(xù)蒸餾 10min后將冷凝管尖端提離液面再蒸餾 1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。 在蒸餾時，水蒸氣發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得?；饠鄽?，否則將發(fā)生倒吸。蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，因此也能發(fā)生上述反應(yīng)，生成紫紅色配合物。因此可用比色法測定蛋白質(zhì)濃度 ? 當(dāng)脲被小心加熱至 150160℃ 時，可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成雙縮脲反應(yīng)方程式如下： ? 雙縮脲在堿性條件下與少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng) 以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣按蛋白質(zhì)含量 40mg、 50mg、 60mg、 70mg、 80mg、 90mg、 100mg、110mg分別稱取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣于 8支 50mL納氏比色管中，然后各加上 1mL四氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液準(zhǔn)確稀釋至50mL，振搖 10min，靜置 1h，取上層清液離心 5min，取離心后的透明液于比色皿中，在 560nm波長下以蒸餾水作參比液調(diào)節(jié)儀器零點并測定各溶液的吸光度值 A。 ?讀數(shù)時要注意讀的是 A的值； ?注意正確標(biāo)記試管（用記號筆清晰標(biāo)記于試管 2/3高處）； ?準(zhǔn)確記時。 紫外分光光度計法 ? 紫外分光光度計 ? 離心機(jī)（ 30005000r/min） 所需試劑 ?95%乙醇 ?無水乙醚 ??8mol/L尿素的 2mol/L氫氧化鈉溶液 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ? 準(zhǔn)備稱取樣品 50ml燒杯中，加入，不斷攪拌 10min鐘使其充分溶解，使四層紗布過濾于玻璃離心管中，以3000~5000r/min的速度離心 5~10min，傾出上清液。以凱式定氮法測得樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，上述吸光度值 A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍(lán)色（生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物），藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色法測定。 該法由于兩步呈色反應(yīng)可以疊加，其靈敏度特別 高，所以適用于 20~250ug微量蛋白質(zhì)的測定，可檢測的最低蛋白質(zhì)量為 福林 酚法試劑配置繁瑣耗時 。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。 ? 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱取牛血清蛋白 10mg,用蒸餾水配成 100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry法要大的多。因而完全不用像 Lowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。如干擾 Lowry法的 K+、 Na+、Tris緩沖液、甘油等均不干擾此測定法。 ? 單指示劑甲醛滴定法 ? 雙指示劑甲醛滴定法 ? 電位滴定法 ? 茚三銅比色法 ? 揮發(fā)性鹽基氮的測定 單指示劑甲醛滴定法 優(yōu)點 ：簡單易行，快速方便 缺點 ： Pro與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低； Tyr含有酚羥基，滴定時會消消耗一些堿使結(jié)果偏高；溶液中有銨則可與甲醛反應(yīng)使結(jié)果偏高。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。 ②百里酚酞乙醇溶液： 1g/L。 ⑷結(jié)果計算 式中 X氨基酸態(tài)氮的含量， g/100g； c 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度， mol/L； V1用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積， mL； V2用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積， mL； m測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量， g； ， g/mmoL。再用 化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至 ，記下消耗。靜置 15min后，在 570nm波長下，以試劑空白為參比液測定各溶液的吸光度 A値。揮發(fā)性鹽基氮遇弱堿氧化鎂即被游離而蒸餾出來，蒸餾出的氨被硼酸吸收后生成硼酸銨，是吸收液變?yōu)閴A性，混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色
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