【文章內(nèi)容簡介】 10 3Pas,n 易于分離 ,n 易于洗脫所分離組分。 Date 48 流動(dòng)相的洗脫作用實(shí)質(zhì)上是 流動(dòng)相分子與被分離的溶質(zhì)分子競爭占據(jù)吸附劑表面活性中心的過程 。 強(qiáng)極性的組分容易被吸附劑所吸附，應(yīng)選用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相才能把它從吸附劑上洗脫下來，使之沿著層析柱前進(jìn)； 弱極性的組分則應(yīng)選用弱極性的流動(dòng)相洗脫之。 Date 49 以聚酰胺為吸附劑時(shí) ,一般用 水 作流動(dòng)相。 以吸附樹脂為吸附劑時(shí)，由于分子間吸附力較弱，可用低級醇、酮或其水溶液洗脫。 原則：n 弱酸性物質(zhì)在酸性下吸附，堿性下洗脫；弱堿性物質(zhì)在堿性下吸附，酸性下洗脫。n 在高濃度鹽溶液中進(jìn)行吸附常用水解吸。n 常用的流動(dòng)相按其極性增強(qiáng)順序排列為 :n 石油醚 環(huán)己烷 二硫化碳 四氯化碳 苯 甲苯 氯仿 乙醚 乙酸乙脂 丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 吡啶 酸。n 在實(shí)踐中一般從極性小到極性大溶劑，通過實(shí)驗(yàn)來選擇。 Date 50表 1 各種溶劑的介電常數(shù)（ * 20℃ ，其他 25 ℃ ） 溶劑 介電常數(shù) 溶劑 介電常數(shù)n己烷 1． 89* 氯仿 4． 81石油醚 2． 0 乙酸丁酯 5． 01*環(huán)己烷 2． 02 乙酸已酯 6． 02四氯化碳 2． 23 吡啶 12． 3苯 2． 27 丙酮 20． 7甲苯 2． 38 乙醇 24． 3甲醇 32． 6 水 78． 5Date 51 在選擇洗脫劑時(shí) ,還可以由各種溶劑按不同配比配成混合溶劑作為流動(dòng)相； 因此流動(dòng)相的種類很多，流動(dòng)相的選擇也就比固定相的選擇更為復(fù)雜。 為了獲得物質(zhì)的最佳分離，尤其是極性相差大的物質(zhì)，應(yīng)采用 洗脫能力遞增的流動(dòng)相 。在實(shí)踐中一般從極性小到極性大溶劑，通過實(shí)驗(yàn)來選擇。 Date 52二 ． 分配層析 Date 53 在一個(gè)有兩相存在的系統(tǒng)中，利用不同物質(zhì)的 分配系數(shù) 不同而使其分離的方法。 在層析分離過程中，這兩種互不混溶的溶劑之一為 流動(dòng)相 ； 另一種是吸收在載體中的溶劑，這種溶劑是鍵合在載體中，在層析過程不流動(dòng)為 固定相 。 例如：以硅膠為支持物，硅膠上鍵合水為固定相，氯仿為流動(dòng)相分離氨基酸就是一個(gè)典型的分配層析實(shí)驗(yàn)。Date 541．原理n 分配層析是根據(jù)欲分離組分在兩種互不混溶（或部分混溶）溶劑間溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)的， 當(dāng)流動(dòng)相帶著試樣中的各種組分沿著層析方向流動(dòng)時(shí)，試樣中的各種組分就在流動(dòng)相和固定相兩種溶劑間進(jìn)行分配， 不同的組分分配系數(shù)有差異時(shí)，它們前進(jìn)的速度就不相同，于是得以分離。 Date 55n 分配層析中的分配系數(shù)以 Kd表示之。 Vs、 Vm分別為固定相和流動(dòng)相的體積， Cs、 Cm為溶質(zhì)在兩相中的濃度。于是： Date 562．固定相及其選擇n 分配層析固定相是通過吸附或鍵合作用于載體上。n 常用的載體應(yīng)符合以下要求： n 具有多孔結(jié)構(gòu)，能保留較多的固定相，并且吸附或鍵合固定相能力較強(qiáng)，以防在洗脫過程中被流動(dòng)相帶走。n 載體有良好的化學(xué)惰性。n 良好的物理化學(xué)惰性。n 價(jià)格低廉，使用方便。 Date 57分配層析中常用的載體有如下幾種：n 硅膠：n 在分配層析中用作載體的硅膠一般在 80℃ 左右活化，使其表面殘留一定量的水分作固定相。n 纖維素：n 層析用纖維素可分為兩種，即天然纖維素和微晶纖維素。前者是由質(zhì)量較好的紙漿，經(jīng)干燥、粉碎后制得，纖維長約 220um， 平均聚合程度為 400500；n 微晶纖維素是由棉花等較純的纖維素，加強(qiáng)酸一起加熱，部分水解后形成的微小晶體纖維素，平均聚合程度為 40~200。 纖維素上有許多羥基，易與水形成氫鍵而將水吸附，這種吸附著的水分形成分配柱層析中的固定相。 Date 583．流動(dòng)相及其選擇 n 分配柱層析中的流動(dòng)相一般是與水不相混溶的有機(jī)溶劑如正丁醇、正戊醇等。n 為了防止層析過程中流動(dòng)相把吸附于擔(dān)體上的少量水分帶走， 流動(dòng)相應(yīng)預(yù)先以水飽和 。n 為了防止某些被分離組分的離解，流動(dòng)相應(yīng)加入醋酸、氨水等弱酸、弱堿。 Date 59n 選擇各組分溶解度相差大的溶劑n 正相層析（固定相極性大于流動(dòng)相極性） 水溶性樣品，極性固定相，非極性展開劑n 反相層析（固定相極性小于流動(dòng)相極性） 親脂性樣品，非極性固定相，極性展開劑 分配層析展開劑選擇分配層析展開劑選擇Date 60化合物 固定相 流動(dòng)相水溶性生物堿 水 或緩沖液 丁醇、乙酸乙酯甙類 水 氯仿或乙酸乙酯酚類 水 環(huán)己烷有機(jī)酸 稀硫酸 環(huán)己烷與氯仿甾體化合物 甲醇 環(huán)己烷乙二醇 甲苯甲酰胺 異丙醚氨基酸的衍生物 不同 pH緩沖液 乙醚、氯仿、正丁醇Date 61三 ． 親和層析 “ 手臂 ”Date 62 親和層析又稱為功能層析。這種層析是利用底物，抗體和抗原等之間的特異性親和力來選擇分離的。 生物大分子具有與其相應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，即在一定條件下某些物質(zhì)只能與某一種生物大分子物質(zhì)結(jié)合而不與其他生物大分子結(jié)合，當(dāng)條件改變時(shí)如溶液 pH或離子強(qiáng)度改變他們又解離。 酶與底物、酶與抑制劑、酶與變構(gòu)效應(yīng)劑、酶與輔酶、激素與細(xì)胞受體、維生素與結(jié)合蛋白、基因與核酸、抗體和抗原、外源凝聚素與紅學(xué)球表面上的抗原等等，都具有這種特異親合的關(guān)系。Date 63Date 64[E0]表示初始濃度。 [L0]表示固定化配體的初始濃度[E]表示游離的生物大分子的濃度。 KL表示生物大分子和配體親和力的大小， [L0]的數(shù)值越大，形成的 EL就越多。 KL的值大，生物大分子對其配體的親和力小，反之，則生物大分子對其配體的親和力就大。E表示待分離的生物大分子， L表示配體， EL代表配體復(fù)合物EL的解離常數(shù) KL為：Date 65n 在親和層析中，一般都盡可能地提高固定化配體的濃度，對于親和力較低的體系更加如此。但是在下列兩種情況下，高的固定化配體是不適宜的： n 體系的親和力特別高，以至于不用強(qiáng)烈的洗脫條件便不能將吸附的大分子洗脫下來。n 如果配體本身帶有電荷，則不能用高濃度固定化配體的載體進(jìn)行親和層析。 n 因?yàn)?，固定化配體濃度高，載體單位面積上固定化配體的密度就大，和其它雜蛋白之間同時(shí)形成的離子鍵的數(shù)目也就多，這種離子交換作用造成的非專一性吸附也就強(qiáng)烈。 Date 662．親和吸附劑的選擇（ 1）配體的選擇 （ 2）基質(zhì)的選擇Date 67作為親和層析的配體須具備 3個(gè)條件： n 在一定的條件下，與純化的物質(zhì)進(jìn)行專一性結(jié)合而且具有較強(qiáng)的親和力。 n 配體和生物大分子結(jié)合后 ,在一定的條件下又能解 離 ,而且無損于生物大分子活性。n 配體具有與基質(zhì)連接的化學(xué)基團(tuán) 。 1）配體的選擇Date 68不溶于水又具有高度