【正文】 吸附,離子交換等；n 有較好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性；n 具有足夠數(shù)量的化學(xué)基團(tuán) ,經(jīng)化學(xué)方法活化后 ,易和配體結(jié)合；n 具有稀松的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。n 由于瓊脂糖鏈間沒(méi)有共價(jià)交聯(lián)，因此它在逆境中很不穩(wěn)定，使用溫度一般在 0－ 40℃ 之間， pH范圍在 4－ 9之間，而 且一般加抗菌劑濕態(tài)保存。n 聚丙烯酰胺凝膠呈干粉狀，加水后溶脹，其結(jié)構(gòu)較緊密，孔小，有些大分子不易滲入。 Date 71葡聚糖凝膠 n 由右旋糖苷經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的珠狀凝膠，商品名為 Sephadex。 Date 72纖維素 n 由葡萄糖殘基組成的鏈狀化合物，但商品纖維素具有不可忽略的吸附性，且結(jié)構(gòu)不均一，限制了其在親和層析中的應(yīng)用。n 多孔玻璃作為無(wú)機(jī)載體具有穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，不同 CPG的孔徑大小適用于從酶和病毒直到完整的細(xì)胞。 Date 743．親和吸附劑的制備n 配體與基質(zhì)偶聯(lián)才能成為親和吸附劑，不同基質(zhì)與配體采用不同的方法，但其制備過(guò)程分步進(jìn)行： n （ 1）基質(zhì)的活化；n （ 2）讓配體與活化的基質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，從而使配體接到基質(zhì)上。n 生成酰肼的衍生物，再經(jīng)過(guò)?；?，烷化或在亞硝酸作用下生成?；B氮的衍生物，從而與另一個(gè)化合物偶聯(lián)。 Date 78Date 79（ 4）多孔玻璃基質(zhì)的偶聯(lián)Date 80（ 5）基團(tuán)特異性吸附劑基團(tuán)特異性吸附劑 基團(tuán)特異性刀豆球蛋白瓊脂糖凝膠(concanavalinAagarose)帶吡喃葡聚糖的大分子及其他糖類物質(zhì)（糖蛋白和糖脂）聚尿苷酸 瓊脂糖凝膠 含有聚腺苷酸的核酸，聚尿苷酸結(jié)合的蛋白質(zhì)聚腺苷酸瓊脂糖凝膠 含有聚尿苷酸的核酸， mRNA連接的蛋白質(zhì)亞胺基二乙酸瓊脂 對(duì)重金屬具有親和力的蛋白質(zhì)Cibracron藍(lán) 瓊脂糖凝膠 帶有核苷酸輔助因子的酶、血清蛋白蛋白質(zhì) A瓊脂糖凝膠 IgG抗體Date 814．親和吸附劑中 “ 手臂 ”Date 82n 為了減少載體的立體障礙，增加配基的活動(dòng)度，往往在配基與載體之間連接一個(gè)具有適當(dāng)比度的 “手臂 ”。Date 83是否商品親合吸附劑選擇凝膠配基 緩沖液中膨化凝膠偶聯(lián)制備凝膠裝柱否 是緩沖液平行層析柱內(nèi)固定相上樣洗脫，除去樣品中的其它物質(zhì)再洗脫，洗脫要分離的大分子物質(zhì)收集并分析所得的洗脫液凝膠再生Date 84n 柱裝好后選用合適的緩沖液平衡柱，所用緩沖液的組成、 pH值和離子強(qiáng)度有利于親合復(fù)合物的形成，通常 選擇中性 pH為吸附條件 。n 如果待分離的物質(zhì)與固定配體之間的親和力較弱，可以連續(xù)地用大體積的平衡柱用的緩沖液洗脫。 Date 86n 有時(shí)可采用 Chaotropic試劑洗脫，即在緩沖液中加入較弱的 變性劑，如尿素，胍 鹽酸， CCl3COO等，變性劑可使生物大分子發(fā)生某種程度的變形，減低親合凝膠上所形成的大分子配基復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而有利于大分子物質(zhì)的洗脫。Date 87n 欲達(dá)到純化的目的可 選擇一種和配基親和力很強(qiáng)的物質(zhì) 加到洗脫緩沖液中洗脫時(shí)，該物質(zhì)及被吸附的大分子物質(zhì)和配基發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，當(dāng)洗脫液內(nèi)物質(zhì)搶占了配基之后，原來(lái)結(jié)合在配基上的生物大分子被取代而脫離配基，這種洗脫方式稱為 專一性洗脫 。n 為了恢復(fù)親和柱的吸附容量，通常把污染了的親和吸附劑與非專一性的蛋白酶一起保溫過(guò)夜，這種方法幾乎可以完全恢復(fù)柱的吸附容量。 Date 89四 ． 凝膠層析 質(zhì) Date 90n 凝膠層析（ Gel Chromatography） 又稱分子篩層析，凝膠過(guò)濾，排阻層析 (elusion chromatography)等。n 用于凝膠層析的凝膠有交聯(lián)葡聚糖（商品名為 Sephadex）,瓊脂糖凝膠（商品名為 Sepharose）和聚丙稀酰胺凝膠（商品名為 BioGel P）以及交聯(lián)聚苯乙烯，氧化鋅交聯(lián)的氯丁橡膠等。n 當(dāng)含有大小分子的混合物樣品加入到色譜柱中。大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙隨洗脫液移動(dòng)，最先流出柱外；而小分子可通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入粒子內(nèi)部，然后再擴(kuò)散出來(lái)，流速緩慢，以至最后流出色譜柱。 Date 92n 當(dāng)兩種以上不同分子量的分子均能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部時(shí)，則由于它們 被排阻和擴(kuò)散程度 不同，在層析柱內(nèi)所經(jīng)過(guò)的 時(shí)間和路程長(zhǎng)短 不同，從而使樣品分子大小不同的物質(zhì)得到分離 。 Date 94n 每個(gè)溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相之間有一個(gè)特定的分配系數(shù) Kd,則它的洗脫體積 Ve為： Ve=Vo+KdVi Date 95Kd可有下列幾種情況： n 當(dāng) Kd=0時(shí)， Ve=Vo,即溶質(zhì)分子完全不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，完全被排阻于凝膠顆粒微孔之外而最先洗脫下來(lái)。n 當(dāng) 0Kd1時(shí) , Ve=Vo+KdVi， 即溶質(zhì)分子以某種程度向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散， Kd愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大，此時(shí) Ve在 Vo與 Vo+Vi之間變化。 Date 96n 可以看出，對(duì)某一凝膠介質(zhì)，兩種全排出的分子即 Kd都等于零，雖然分子大小有差別，但不能有分離效果。因此不同型號(hào)的凝膠介質(zhì)，有它一定的使用范圍。n Vi可由 Wg求得， g為干凝膠重 (g)， WR為凝膠的吸水量(ml/g)， 或選用一個(gè)自由擴(kuò)散的小分子通過(guò)色譜床，此時(shí)Kd=1，則 Vi=VeVo。 如 Sephadex G100， 型號(hào)后的數(shù)字表示凝膠的得水率乘以 10，其得水率為 10，即1克 G100干凝膠膨化時(shí)能吸收 10克水。Date 99 排阻極限是指不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)部的最小溶質(zhì)分子的分子量。（ 2）排阻極限（ exclusion limit）Date 100n 使溶質(zhì)分子在某種凝膠中得到很理想的線性分離的范圍就稱為這種 凝膠的分級(jí)分離范圍 （ Fractionation rage）。 Date 1013 ．凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) n 天然的和人工合成的凝膠種類很多，但是能夠用于凝膠層析的種類很少。n 凝膠的化學(xué)性質(zhì)是穩(wěn)定的。n 凝膠上必須具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，防止在液流作用下變形。 Date 103（ 1）葡聚糖凝膠n 葡聚糖凝膠是由葡聚糖與環(huán)氧化氯丙烷通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)形成的三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。強(qiáng)酸溶液中其糖苷鍵易水解。n 層析之后只要防止微生物生長(zhǎng)，葡聚糖凝膠可反復(fù)使用多次，一般可在 100oC煮沸 40min消毒。（ 1）葡聚糖凝膠Date 105（ 2）聚丙稀酰胺凝膠n 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’ 次甲基雙丙烯酰胺共價(jià)聚合而成的。n 聚丙烯酰胺凝膠和葡萄糖凝膠在層析性質(zhì)和吸附性能上極其相似，在 pH110的緩沖液內(nèi)，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均不發(fā)生明顯的變化。n 瓊脂糖制成的這種凝膠，由于分子內(nèi)和分子間氫鍵，使得凝膠結(jié)構(gòu)具有較大的穩(wěn)定性。 Date 107n 在以水為溶劑的緩沖液、高濃度鹽溶液及乙醇中，其結(jié)構(gòu)和性能均不受影響，一般操作溫度在 030℃ 。n 這類凝膠商品常懸浮于 %的疊氮化鈉水