【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 卵巢或周圍臟器損傷，引起盆腔大量?jī)?nèi)出血，包括腹膜后血腫，應(yīng)在輸液或輸血條件下，立即開(kāi)腹手術(shù)。臨近臟器的損傷：包括臨近的膀胱、直腸、血管甚至輸尿管的損傷，應(yīng)及時(shí)發(fā)現(xiàn)，積極處理。感染：術(shù)后出現(xiàn)明顯的腹痛、體溫升高、白細(xì)胞升高等征象提示感染發(fā)生，應(yīng)給予抗炎治療，注意鑒別診斷，OHSS也可出現(xiàn)下腹部壓痛、肌緊張、反跳痛、體溫上升、白細(xì)胞上升。出血、感染、損傷的預(yù)防：（1）術(shù)前作好外陰、陰道、宮頸的沖洗消毒，預(yù)防性使用抗生素，減少穿刺次數(shù)。（2）手術(shù)醫(yī)師應(yīng)熟練掌握盆腔B超影像學(xué)，正確掌握各器官、大血管和卵巢、卵泡的圖像特征，切不可誤穿。（3） 卵巢因?yàn)檠装Y而粘連，固定于盆腔較高位置，穿刺困難，必須經(jīng)過(guò)子宮時(shí)，應(yīng)盡量選擇穿刺宮頸，避免穿入子宮體和子宮峽部。第十四節(jié) 臨床結(jié)局的判斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范生化妊娠：胚胎移植后14天血HCG≥10 miu/ml（酶聯(lián)免疫）,或尿HCG陽(yáng)性，提示生化妊娠。生化妊娠率=生化妊娠數(shù)/ET周期數(shù)。臨床妊娠：胚胎移植后28天，B超見(jiàn)孕囊，確診為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/ET周期數(shù)。第十五節(jié) 復(fù)診病人處理當(dāng)患者在本中心有兩次IVFET失敗病史時(shí)，在申請(qǐng)第三次行IVFET治療時(shí)，治療方案必須在包括臨床醫(yī)生、實(shí)驗(yàn)室工作人員、護(hù)理人員的討論會(huì)議上制訂。二次IVF超排周期之間的間隔要大于3個(gè)月。前次常規(guī)IVF受精率30％或完全不受精時(shí)，再次IVF治療時(shí)，應(yīng)先調(diào)查可能的不受精原因，必要時(shí)行ICSI操作。對(duì)復(fù)診病例，接診醫(yī)師必須詳細(xì)重溫原病歷，進(jìn)行必要的檢查以確定新的治療方案，若發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)向上級(jí)醫(yī)師匯報(bào)并詳細(xì)記錄。 第二部分 培養(yǎng)室操作常規(guī)第一節(jié) 進(jìn)出培養(yǎng)室須知非本室工作人員未經(jīng)同意不得進(jìn)入培養(yǎng)室。進(jìn)入培養(yǎng)室的人員須嚴(yán)格遵守培養(yǎng)室制度。入培養(yǎng)室前須換洗手衣，戴口罩、帽子，用肥皂洗手后再穿手術(shù)衣，并換培養(yǎng)室專用拖鞋，用75%酒精擦手，待手完全干后方可入培養(yǎng)室。培養(yǎng)室工作人員完成當(dāng)天工作后，在所有操作臺(tái)上無(wú)卵子及胚胎情況下才可進(jìn)行臺(tái)面消毒清潔；用75%酒精紗布擦拭（注意不要用太濕的75%酒精紗布）；在中午離開(kāi)前的清潔工作不用75%酒精擦拭而用超純水；離開(kāi)培養(yǎng)室前，要關(guān)掉所有顯微鏡的電源開(kāi)關(guān)。第二節(jié) 材料的基本要求與配子或胚胎接觸的材料須經(jīng)證實(shí)對(duì)胚胎無(wú)毒、無(wú)污染。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立常規(guī)的質(zhì)控方法和操作規(guī)程，并能提供有關(guān)記錄。所有商品培養(yǎng)試劑都須具備產(chǎn)品代號(hào)、生產(chǎn)日期、胚胎毒性試驗(yàn)結(jié)果、滲透壓、PH、過(guò)期日期等資料。分裝試劑須注明分裝日期及原試劑所注之各項(xiàng)資料。①必須在恰當(dāng)保存條件下保存所有物品。②原裝培養(yǎng)液等液體試劑開(kāi)封后，恰當(dāng)保存條件下使用期不得超過(guò)1個(gè)月。③必須使用專供人類IVFET的各種商品試劑，并具備進(jìn)貨途徑的憑據(jù)和記錄。自配試劑在冷藏條件下，使用期不得超過(guò)1周。第三節(jié) 培養(yǎng)基接收及放置接受培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)注意輸送箱內(nèi)是否有冷藏，并核對(duì)培養(yǎng)基種類、數(shù)目和培養(yǎng)基的有效期。將培養(yǎng)基外包裝用75%酒精紗布擦拭，再用消毒紗布擦干后放入冰箱。如有不同供應(yīng)商的培養(yǎng)基，則應(yīng)明確標(biāo)明，分別放置，并告知所有培養(yǎng)室工作人員。不同有效期的同一類培養(yǎng)基不能混合放置。已過(guò)有效期的培養(yǎng)基如不丟棄則應(yīng)另外放置并明確標(biāo)記。培養(yǎng)基接收者在記事本上記錄所接收培養(yǎng)基的供貨商、培養(yǎng)基名稱數(shù)量、培養(yǎng)基有效期、接收日期并簽名，所有特殊情況均需記錄。第四節(jié) 培養(yǎng)箱培養(yǎng)室工作人員每天早上進(jìn)入培養(yǎng)室前先到氣瓶間檢查CO2氣瓶的壓力，進(jìn)入培養(yǎng)室后要先進(jìn)行培養(yǎng)箱監(jiān)測(cè)，培養(yǎng)箱監(jiān)測(cè)應(yīng)一天進(jìn)行1次。每天監(jiān)測(cè)的內(nèi)容記錄在專用的記錄表上并簽名。根據(jù)培養(yǎng)基型號(hào)的不同CO2濃度應(yīng)在5%~%，溫度應(yīng)為37176。C177。如超出該范圍需對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行校正。CO2氣瓶間有兩組共4個(gè)CO2氣瓶，當(dāng)一組氣瓶的壓力下降接近0時(shí)將自動(dòng)切換至另一組氣瓶，此時(shí)將用完的2個(gè)氣瓶卸下并更換新的CO2氣瓶。更換氣瓶時(shí)應(yīng)先將減壓閥關(guān)閉（旋松），再關(guān)上舊氣瓶的總閥，將減壓閥從舊的氣瓶上換至新的氣瓶上，打開(kāi)新氣瓶的總閥，再打開(kāi)減壓閥（旋緊），順序不可顛倒以免沖壞減壓閥。外置CODA過(guò)濾器應(yīng)在氣瓶更換時(shí)同時(shí)更換。培養(yǎng)箱內(nèi)的水每2周更換一次，更換原則為在培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)培養(yǎng)基和卵子胚胎的情況下進(jìn)行，培養(yǎng)箱內(nèi)的水使用超純水。正常情況下培養(yǎng)箱每1~2個(gè)月進(jìn)行消毒一次，特殊情況下（如發(fā)現(xiàn)有污染現(xiàn)象）即時(shí)消毒。培養(yǎng)箱消毒應(yīng)在一天工作完成后，工作臺(tái)面內(nèi)無(wú)卵子胚胎情況下進(jìn)行，酒精消毒步驟不得在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)箱清潔消毒步驟為先拆卸培養(yǎng)箱內(nèi)所有鋼架，清水沖洗，干后用 75％酒精擦洗，干后再用超純水沖洗；培養(yǎng)箱內(nèi)壁和門用75％酒精擦拭，干后再用超純水擦拭；鋼架裝回后將門開(kāi)啟至確保所有擦拭過(guò)的部位均已干；第2天再將培養(yǎng)箱內(nèi)裝水。清潔消毒后的培養(yǎng)箱48小時(shí)后才可再進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。所有消毒、換水操作日期均應(yīng)記錄在培養(yǎng)箱上的記錄表上。第五節(jié) 培養(yǎng)基及油準(zhǔn)備培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取培養(yǎng)基盡量用單獨(dú)包裝的移液管而不用巴斯德吸管，尤其是當(dāng)該瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基當(dāng)天用不完，還需留待以后再用時(shí)必須使用單獨(dú)包裝的移液管（如IVFGAMAET等），或?qū)⑿枭倭慷啻问褂玫呐囵B(yǎng)液分裝使用。有開(kāi)啟的物品均要明確記錄開(kāi)啟日期。開(kāi)啟培養(yǎng)基瓶時(shí)，注意手不能碰到接觸培養(yǎng)基的瓶塞部位，如需放下瓶塞，準(zhǔn)備一個(gè)干凈的培養(yǎng)皿，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，將瓶塞向下放到培養(yǎng)皿上。進(jìn)行胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液須提前在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過(guò)夜后使用，在培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)液超過(guò)48小時(shí)不再使用。進(jìn)行培養(yǎng)基準(zhǔn)備時(shí)，所有未蓋油的培養(yǎng)基均不能放在熱臺(tái)上以避免水分蒸發(fā)。胚胎培養(yǎng)使用的油為即用型，使用前需在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡；如油裝在皿中需平衡過(guò)夜，如油裝在瓶?jī)?nèi)則需平衡48小時(shí)才能使用。每天下午準(zhǔn)備次日所用的需提前置入培養(yǎng)箱平衡的培養(yǎng)基，應(yīng)包括次日取卵、精子處理、體外受精（含ICSI）及胚胎移植所需的培養(yǎng)液：①取卵：每個(gè)患者準(zhǔn)備4個(gè)Falcon 3001皿，其中2個(gè)皿蓋上寫上患者的姓名，每個(gè)皿中用移液管吸入2~（IVF30），此液可用前一天放入培養(yǎng)箱而當(dāng)天未用完的培養(yǎng)液（須在皿蓋上做標(biāo)記以區(qū)別），也可用當(dāng)天新開(kāi)啟的培養(yǎng)液（寫有名字的皿盡量用當(dāng)天新開(kāi)啟的培養(yǎng)液）。每個(gè)患者準(zhǔn)備1支裝有肝素化PBS（100ml ）的15ml試管，試管上標(biāo)明PBS。②精子處理及體外受精：包括Spermrinse和IVF30，Spermrinse每個(gè)患者準(zhǔn)備2 ml，如是PESA和TESE患者則需準(zhǔn)備5ml；IVF30每個(gè)患者約需4ml（此液應(yīng)是當(dāng)天新開(kāi)啟的培養(yǎng)液）。③胚胎移植：根據(jù)次日ET的患者人數(shù)準(zhǔn)備培養(yǎng)液，每2個(gè)ET準(zhǔn)備1支ET沖管液（3~4ml），管上寫明日期，每個(gè)ET另準(zhǔn)備1 m1IVF30以備第二天做ET皿時(shí)用。準(zhǔn)備次日ET的所有培養(yǎng)基均是當(dāng)天新開(kāi)啟的。準(zhǔn)備以上培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)盡快，減少開(kāi)封的培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱外的時(shí)間。另外放置足夠次日使用的油，如是用瓶裝則需更前一天放置。每個(gè)患者準(zhǔn)備一個(gè)寫有名字的標(biāo)簽貼在培養(yǎng)箱外門上相應(yīng)位置。第六節(jié) 精液處理和體外受精在進(jìn)入IVF治療周期的患者取卵當(dāng)日，患者的丈夫用手淫法取精，精液收集在無(wú)菌、無(wú)毒的容器內(nèi)（須是一次性用品，因殘留的洗滌劑對(duì)精子是有毒性的），室溫下液化后，先作精液常規(guī)分析，然后進(jìn)行精子處理，以獲得質(zhì)量好的精子進(jìn)行體外受精。精液常規(guī)分析精液液化后進(jìn)行精子計(jì)數(shù)、活動(dòng)率和活動(dòng)力分析，精子計(jì)數(shù)有以下方法：（1）用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央有兩個(gè)相同的計(jì)數(shù)池，每個(gè)計(jì)數(shù)池分為9個(gè)大方格，每格長(zhǎng)寬各1mm，四角的每個(gè)大方格又分為16個(gè)中方格，為計(jì)數(shù)白細(xì)胞用；中間的一個(gè)大方格用雙線分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又用單線劃分為16個(gè)小方格，為計(jì)數(shù)紅細(xì)胞之用。精子計(jì)數(shù)用的是計(jì)數(shù)白細(xì)胞的大方格（A，B，C，D），蓋上蓋玻片時(shí)。（2）用精子專用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)精子專用計(jì)數(shù)板由底盤和蓋板組成。底盤中央有觀察平臺(tái)，平臺(tái)周圍有三個(gè)水晶的小圓柱，小圓柱比平臺(tái)高10um，當(dāng)蓋板蓋在檢查平臺(tái)上時(shí)，由于水晶圓柱的支撐使兩者之間的距離保持在10um，因而每個(gè)小格的體積為11010 L，10個(gè)小格內(nèi)的體積即為1109 L。計(jì)數(shù)時(shí)分別計(jì)數(shù)3個(gè)不同區(qū)域的10個(gè)小方格內(nèi)的精子總數(shù)，取其平均值。如10個(gè)小方格內(nèi)精子總數(shù)平均為20條，則精子密度即為20109/L（或20106／m1）。109／L，進(jìn)行精液處理的工作人員應(yīng)通知培養(yǎng)室內(nèi)的工作人員以決定是否改為ICSI。精子處理（1）如活精數(shù)＜1條／HP，用離心法處理精液?；罹?條／HP的精液用Spermgrade 或Pureception密度梯度離心法。Pureception市售的有已配制好的“上層液體”（40％）與“下層液體”（80％）的兩種液體可方便直接制成二層密度梯度。（2）制備密度梯度方法（以Pureception為例）：用一吸管，在一無(wú)菌、~“上層液體”，另取一支吸管，插入上層液體下加等量的“下層液體”，使形成界面，并注意不要擾亂這個(gè)界面。（3）IVF治療的精液準(zhǔn)備常規(guī)：①每份精液準(zhǔn)備1支15ml離心管標(biāo)上Pureception和患者姓名，另準(zhǔn)備2支試管分別標(biāo)上Spermrinse、IVF30和患者姓名。②從冰箱取出保存的Pureception制成密度梯度離心液體，從培養(yǎng)箱取出平衡過(guò)夜的Spermrinse、IVF30，用移液管各抽取2ml置于相應(yīng)離心管內(nèi)， IVF30調(diào)精用。③洗精前需進(jìn)行精液常規(guī)檢查，用Markler板計(jì)數(shù)精子數(shù)目、活動(dòng)力、活動(dòng)率，如需計(jì)算畸形率，則需涂片固定。④將完全液化的精液移入Pureception離心管中，如精液量太多（5m1），則可棄去部分精液或用兩支離心管，300g離心20分鐘。⑤棄去上清，將沉淀移入Spermrinse管中，200g離心5分鐘。⑥棄去上清，將沉淀移入IVF30管中，200g離心5分鐘。⑦棄去上清，保留底層沉淀，加入IVF30培養(yǎng)液至lml。若沉淀少，~，上游15~30分鐘，將上層懸浮液移入標(biāo)有患者姓名的小試管中。⑧用Markler板計(jì)數(shù)活動(dòng)精子數(shù)目，~109／L的授精液所需的精液量，用微量加樣器吸取所需精液量， IVF30的試管中，混勻后，再用Markler板檢查精子濃度是否符合，如不符合，則繼續(xù)調(diào)節(jié)。⑨用調(diào)好濃度的授精液在標(biāo)有患者姓名的授精皿中（3002）做數(shù)個(gè)授精滴，每個(gè)液滴100u1，另外皿中再用培養(yǎng)液做4個(gè)小液滴以備次日沖洗卵子用，上覆礦物油。置于培養(yǎng)箱中，平衡約2小時(shí)后才可將卵子移入授精液滴中，每滴可加卵子1~3個(gè)。體外受精：在取卵后4~6小時(shí)進(jìn)行，每個(gè)患者準(zhǔn)備1支巴斯德吸管，把管口燒光滑后使用。PESA精子處理：如當(dāng)天有PESA患者，培養(yǎng)室工作人員在早上準(zhǔn)備2個(gè)寫有患者姓名的3001皿，~（Spermrinse）放入培養(yǎng)箱備用。進(jìn)行附睪穿刺時(shí)，操作穿刺的醫(yī)生用注射器吸取皿里的液體，穿刺后將抽吸液注回皿中，培養(yǎng)室工作人員將皿置于倒置顯微鏡下觀察是否有活精，根據(jù)精子的數(shù)量多少，可選擇直接離心或密度梯度離心處理，室溫下存放。TESE精子處理：準(zhǔn)備1個(gè)3001皿、1個(gè)3002皿，標(biāo)明患者姓名，吸入精子處理液，放入培養(yǎng)箱備用。睪丸穿刺時(shí)，將3001皿交給穿刺的醫(yī)生，醫(yī)生將取出的睪丸組織放入3001皿交還給培養(yǎng)室工作人員。培養(yǎng)室工作人員準(zhǔn)備2支帶針頭的1ml注射器，將組織物移入3002皿，在解剖鏡下用注射器針頭撕碎曲細(xì)精管，再置于倒置顯微鏡下觀察有無(wú)精子，室溫下培育2小時(shí)后離心處理，用于ICSI。第七節(jié) 拾卵培養(yǎng)液準(zhǔn)備：前一天準(zhǔn)備好。取卵前準(zhǔn)備：按當(dāng)天取卵人數(shù)將Falcon 3003皿放到恒溫平臺(tái)上預(yù)熱，準(zhǔn)備好取卵記錄紙，打開(kāi)取卵用恒溫試管架電源，并用溫度計(jì)測(cè)量其溫度是否為37℃，取卵即將開(kāi)始前取出2支巴斯德吸管，在酒精燈上將其毛糙的邊緣燒至光滑以備拾卵時(shí)用，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出一個(gè)該患者的未寫姓名的取卵用皿放到恒溫平臺(tái)上。拾卵開(kāi)始前核對(duì)患者姓名、年齡、IVF治療周期數(shù)。拾卵操作：拾卵時(shí)，將1支試管的卵泡液倒入3003皿中，晃動(dòng)液面使液體均勻分布在皿中，然后傾斜一小角度使液體相對(duì)集中，再按從前向后、從左向右的順序迅速用肉眼識(shí)別卵子。卵子顆粒細(xì)胞復(fù)合體（OCC）通常表現(xiàn)為半透明不定形的松散結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)OCC后在低倍解剖鏡下證實(shí)，如OCC周圍有血塊和粗黑的顆粒細(xì)胞，在解剖鏡下用吸管進(jìn)行割除，然后用巴斯德吸管將OCC移入洗卵的3001皿中，注意不要打入過(guò)多的卵泡液。為了不遺漏卵子，須再晃動(dòng)液體使其重新分布，然后重復(fù)上述步驟，并記錄卵泡數(shù)、卵泡液量、性質(zhì)和獲卵數(shù)。拾卵時(shí)，每5分鐘應(yīng)用另一支吸管將卵子從沖洗皿中移入寫有名字的3001皿，并放入培養(yǎng)箱內(nèi)。不同的患者不能用同一支吸管，用過(guò)的吸管及時(shí)丟棄。如拾卵時(shí)有卵泡液濺在臺(tái)面上，可用干的消毒紗布擦拭，待所有工作完成后才可用去污劑和酒精清潔。第八節(jié) 胚胎培養(yǎng)皿制備所有取卵完成后進(jìn)行胚胎培養(yǎng)生長(zhǎng)皿（GM皿）制備。上午準(zhǔn)備當(dāng)天ICSI患者當(dāng)天用的GM皿，用前一天放入培養(yǎng)箱已平衡的IVF30制備，皿上標(biāo)明“舊”。下午準(zhǔn)備當(dāng)天取卵的常規(guī)IVF患者及ICSI患者的第2天所用的GM皿，用從冰箱拿出的新開(kāi)啟的IVF30制備，ICSI患者的GM皿上標(biāo)明“新”字。每個(gè)皿蓋上寫明患者的姓名，當(dāng)一個(gè)患者的GM皿超過(guò)2個(gè)，應(yīng)在皿蓋上注明GMGM2等表明順序，并在每個(gè)皿蓋（底）上標(biāo)明該皿中的培養(yǎng)液滴序號(hào)。用單獨(dú)包裝的移液管從IVF瓶中吸出適量的培養(yǎng)液置入一支小試管中做GM用，試管上標(biāo)明“IVF”，另吸取少許培養(yǎng)液置入另一支小試管沖洗巴斯德吸管用，試管上標(biāo)明“沖”字。取出一支巴斯德吸管，在酒精燈火焰上烤一下，冷卻后在標(biāo)有“沖”字的試管中進(jìn)行沖洗后，開(kāi)始進(jìn)行GM制備。開(kāi)始前從培養(yǎng)箱內(nèi)取出已平衡的油。GM皿用3001皿，每個(gè)皿中制備的胚胎培