【正文】 浸潤區(qū)的顏色應(yīng)均勻一致，將其與標(biāo)準(zhǔn)帶比較，讀出pH值。精液的顯微鏡檢查：包括精子密度、活力、存活率、凝集、非精子細(xì)胞成分的測(cè)定和精子的形態(tài)學(xué)分析。使用相差顯微鏡。①、精子密度初檢：如果每個(gè)視野的精子數(shù)目差異較大，提示標(biāo)本不均勻。此時(shí)應(yīng)再次吹打混勻標(biāo)本，再次取樣、檢測(cè)。如果每視野精子少于1～2個(gè)，報(bào)告精子密度為2106／ml，同時(shí)注明能否看到活動(dòng)精子即可。如果顯微鏡檢未見精子，應(yīng)離心確定沉渣中有無精子。將精液全部吸入離心管在3000g離心15分鐘。在顯微鏡檢查沉渣仍無精子，方可作出無精子癥的判斷。②、精子活力的評(píng)估：觀察至少5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)精子進(jìn)行分級(jí)。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)把精子活力分為a、b、c、d四級(jí)：“a”級(jí)：快速前向運(yùn)動(dòng) ( 即37℃ 時(shí)速度≥25181。m/s，或20 ℃速度≥ 20181。m/s)?！癰” 級(jí)：慢速或呆滯的前向運(yùn)動(dòng)（525181。m/s）。“c”級(jí)：非前向運(yùn)動(dòng)(5181。m/s)?！癲”級(jí)：不動(dòng)。首先計(jì)數(shù)a級(jí)、b級(jí)精子，隨后在同一視野計(jì)數(shù)c級(jí)d級(jí)精子。計(jì)算各級(jí)精子占所有計(jì)數(shù)精子的百分比。③、精子凝集：是指活動(dòng)精子以不同方式，頭對(duì)頭、尾對(duì)尾或混合型彼此粘在一起。不活動(dòng)精子之間，活動(dòng)精子與粘液絲之間，活動(dòng)精子與非精子細(xì)胞成分、細(xì)胞碎片等粘在一起，不能視為凝集，但應(yīng)照常記錄。凝集的記錄采用半定量的分級(jí)方法：沒有凝集(—)，有凝集可根據(jù)其程度用(+)、(++)、(+++)表示，所有活動(dòng)的精子都凝集在一起為(+++)。出現(xiàn)凝集，提示存在不育的免疫原因，但不能充分證明這點(diǎn)。隨機(jī)選擇10個(gè)視野檢測(cè)凝集。精子成簇一起的平均百分率被定為5％左右。凝集的程度可能很重要，即使只有幾個(gè)精子凝集成為數(shù)目很少的團(tuán)塊也應(yīng)記錄。要記錄凝集的類型，如頭對(duì)頭、中段對(duì)中段、尾對(duì)尾或幾種類型同時(shí)出現(xiàn)的混合型。④、精子存活率：％伊紅Y溶液染色。將一滴新鮮精液與一滴伊紅溶液在載玻片上混勻，覆蓋玻片，30秒后在400倍顯微鏡下至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子，記數(shù)活精子(未染色)占所有精子的百分比。(死精子染為紅色)。也可采用低滲腫脹實(shí)驗(yàn)，即將一滴蒸餾水滴加到精子涂片上，觀察精子尾巴卷曲腫脹的精子占所有精子的百分比。⑤、精子密度的測(cè)定：A、用Macro Chamber計(jì)數(shù)：直接將液化后精液10181。l加入Macro Chamber載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。靜置一分鐘后，在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)十個(gè)格子內(nèi)有完整結(jié)構(gòu)的精子，計(jì)數(shù)結(jié)果直接106／ml,即為精子密度。如果一個(gè)精子位于相鄰兩格分界線上，只計(jì)數(shù)位于方格上界和左界的精子。B、 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：取20 ，混勻。用一滴水濕潤手指，輕輕濕潤計(jì)數(shù)池的兩側(cè)，確保蓋玻片緊貼在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上。向血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的上下兩個(gè)計(jì)數(shù)池分別注入約10ul充分混勻后的稀釋精液，靜置5分鐘，在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)中央5個(gè)大方格中有完整結(jié)構(gòu)的精子，計(jì)數(shù)結(jié)果直接106／ml即為精子密度。如果一個(gè)精子在相鄰兩格分界線上，只計(jì)數(shù)位于方格上界和左界的精子。⑥、非精子細(xì)胞成分：精液中非精子細(xì)胞成分( 統(tǒng)稱“圓細(xì)胞”)，包括泌尿生殖道的上皮細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、生精細(xì)胞和白細(xì)胞。正常精液圓細(xì)胞數(shù)應(yīng) 5106／ml；白細(xì)胞應(yīng)1106／ml。精子形態(tài)檢查①制片：從新鮮精液中涂雙份片子，注意玻片要徹底洗干凈，并用70％酒精洗滌后干燥，滴一小滴( 5~20181。l )于玻片上，如果精子密度超過20106／ml，取5 181。l精液；如果精子密度小于20106／ml，應(yīng)取10~20181。l精液。涂片采取“拉薄”技術(shù)：用第二張玻片的邊緣在清潔的玻片表面拖拉一滴精液。注意涂片不宜太厚。當(dāng)精液粘稠時(shí)，可滴一滴精液于一張玻片中央，然后將第二張玻片表面朝下蓋在其上，以使精液在兩張玻片之間擴(kuò)散，再輕拉使兩玻片分開即可得到兩張片子。② 染色： Diff—Quik精子形態(tài)快速染色方法(試劑盒)。 A、將A液滴在玻片上15秒。 B、將玻片直立于吸水紙上出去多余的液體。 C、將B液滴在玻片上10秒。 D、將C液滴在玻片上510秒。 E、將玻片直立于吸水紙上去除多余液體。 F、自來水下沖洗。 G、自然干燥。 H、顯微鏡下觀察。 ③觀察：染色后精子頭部頂體區(qū)呈淡藍(lán)色，頂體后區(qū)呈深藍(lán)色，體尾部呈淡紅色。胞質(zhì)小滴位于頭部后面或中段周圍，呈淡紅色。④形態(tài)分類：采用Krllger嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)分類，只有頭、頸、中段和尾部都正常的精子才被認(rèn)為是正常形態(tài)精子。正常形態(tài)精子：頭部的形狀呈橢圓形，長4～5181。m，～，～；頂體的界限清晰，占頭部的40％70％；中段細(xì)，寬度1181。m，并且在軸線上緊貼頭部；胞漿小滴小于正常頭部大小的一半；尾部直、均一，較中段細(xì)，長度約45181。m 。所有形態(tài)學(xué)處于臨界狀態(tài)的精子均列為異常。四、外科取精術(shù)適應(yīng)癥：（1） 多次精液常規(guī)檢查示精液中無精子，需檢查生精功能的患者。（2） 梗阻性無精或取精極度困難患者行ICSI助孕的取精準(zhǔn)備。禁忌癥：（1） 急性生殖系統(tǒng)炎癥或慢性炎癥急性發(fā)作。（2） 體溫大于38℃者。術(shù)前準(zhǔn)備：告知患者手術(shù)的目的及可能伴有出血、感染、血腫、部分器官功能損害等并發(fā)癥。少數(shù)病人因無法從附睪中取出精子還需行經(jīng)皮睪丸細(xì)針穿刺取精術(shù)。簽署知情同意書，做好手術(shù)器械準(zhǔn)備。手術(shù)步驟：（1）經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（PESA）：患者取截石位，用碘伏常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)域，鋪無菌孔巾，以2%利多卡因5ml行手術(shù)側(cè)精索阻滯麻醉后，用7號(hào)輸液頭皮針連10ml注射器吸取精子培養(yǎng)液( spermrinse)1ml。左手固定手術(shù)側(cè)睪丸和附睪，右手握頭皮針經(jīng)皮穿刺附睪，由助手抽吸10ml注射器，反復(fù)抽吸，一邊穿刺一邊抽吸，直至針頭端有淡黃渾濁附睪液體抽出。如果未見液體抽出，則改變頭皮針方向多點(diǎn)穿刺，重復(fù)上述抽吸步驟。如果是診斷性穿刺，則只需將抽吸的附睪液涂片，顯微鏡下觀察是否有運(yùn)動(dòng)的精子即可；如果是行ICSI需要取精，則將抽吸的附睪液全部注入小培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下尋找活動(dòng)的精子，如發(fā)現(xiàn)有精子，將抽吸的液體在1500 rpm/min離心10分鐘，取沉渣，尋找精子于取卵當(dāng)天下午進(jìn)行ICSI。如提取中無精子或無活動(dòng)精子則行重復(fù)穿刺或行對(duì)側(cè)附睪穿刺，如仍無精子，則考慮行經(jīng)皮睪丸細(xì)針穿刺取精術(shù)。（2）經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)（TESA）。手術(shù)步驟：體位、消毒及麻醉方法同（PESA），用7號(hào)輸液頭皮針連10ml注射器吸取 Gamete 液1ml。左手固定手術(shù)側(cè)睪丸，右手握頭皮針避開皮膚血管刺入睪丸內(nèi)，由助手抽吸10ml注射器，保持注射器內(nèi)負(fù)壓，穿刺針在睪丸內(nèi)反復(fù)運(yùn)動(dòng)，直到淡黃色的液體流出或出現(xiàn)血性液體，小心拔出穿刺針，將針尖帶出的曲細(xì)精管用小蚊式鉗夾出一同將抽吸液全部放入小培養(yǎng)皿，在解剖顯微鏡下用2支1ml注射器針頭撕碎曲細(xì)精管，然后用吸管吹打均勻并吸入離心管，放培養(yǎng)箱中孵育一段時(shí)間讓成熟活動(dòng)精子游出，去除大塊組織，將混懸液在1500 rpm/min離心10分鐘，取沉渣尋找成熟活動(dòng)精子進(jìn)行ICSI。如為診斷性穿刺則將曲細(xì)精管撕碎后迅速置倒置顯微鏡下尋找有沒有精子。如沒發(fā)現(xiàn)精子，則考慮行多點(diǎn)法穿刺再檢測(cè)，方可得出結(jié)論。注意事項(xiàng)：（1）穿刺應(yīng)避開陰囊、精索血管。（2）睪丸穿刺針不應(yīng)沿長軸穿過睪丸，以免損傷睪丸小葉結(jié)構(gòu)。（3）若抽吸出的液體性質(zhì)不明，立即更換穿刺針及針筒，穿出物送細(xì)胞學(xué)檢查。每更換穿刺部位，應(yīng)更換穿刺針及針筒。（4）術(shù)后留觀2小時(shí)，當(dāng)天避免劇烈活動(dòng)，術(shù)后服用3天的抗生素，2星期內(nèi)避免性生活。五、CASA精液分析流程 打開主機(jī)外設(shè)電源：顯微鏡、打印機(jī)、加溫器等 打開主機(jī)(計(jì)算機(jī))電源 打開精子檢測(cè)菜單 調(diào)試顯微鏡 、系統(tǒng)加溫 檢測(cè)時(shí)載物臺(tái)達(dá)到并保持37℃，才能避免低溫對(duì)精子活力的影響 。 填寫病歷 應(yīng)詳細(xì)、認(rèn)真填寫完整，保證病歷的可靠性并保存。 制作樣品 嚴(yán)格按規(guī)程加樣，減少加樣誤差。 選擇檢測(cè)的視野，檢測(cè)的 檢測(cè)、調(diào)整 減去混入的雜質(zhì)， 精子數(shù)應(yīng)大于200個(gè)。 正確判斷畸形精子并記錄。 預(yù)覽無誤 打印結(jié)果 復(fù)核后簽名 返回原操作系統(tǒng)，用清水沖洗計(jì)數(shù)板，無菌紗布檫干，準(zhǔn)備下一個(gè)樣本的檢測(cè)。 結(jié)束檢測(cè)程序，關(guān)閉電腦和所有電源，蓋上罩子。注意：本儀器必須由受過培訓(xùn)的有專業(yè)技術(shù)資格的人員操作使用，由專人保管和維護(hù)。本操作流程是使用說明的簡化，如果想詳知各項(xiàng)的內(nèi)涵，請(qǐng)查看桌面上的使用說明中的有關(guān)內(nèi)容。本系統(tǒng)是專用設(shè)備，不能玩游戲，以免染上病毒造成系統(tǒng)破壞。該系統(tǒng)常選擇20倍的物鏡檢測(cè)。在轉(zhuǎn)換鏡頭時(shí)注意避免損壞鏡頭。樣本只能加5~7181。l，標(biāo)本放在載物臺(tái)上后稍等一會(huì)兒讓精液靜止下來，如果精液處于流動(dòng)狀態(tài)則結(jié)果會(huì)失真。精液標(biāo)本放在載物臺(tái)上后，檢測(cè)盡可能在10分鐘內(nèi)完成，否則因精子聚光會(huì)使結(jié)果失真。正式檢測(cè)以前必須將溫度加到37℃，并保持此溫度，否則會(huì)影響精子活力。根據(jù)精子密度選擇檢測(cè)的視野數(shù)，一般為3~20個(gè)視野，檢測(cè)精子數(shù)在200個(gè)以上。如果精子密度太低則應(yīng)選擇人工計(jì)數(shù)或離心后查找精子。六、IVF精液處理一、注意事項(xiàng)：必須為受檢者提供《精液標(biāo)本采集須知》或口頭簡要說明。盡量要求病人在本中心的取精室取精，在外取精需在30分鐘內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室；且要求病人簽署院外取精協(xié)議書。核對(duì)病人姓名后，給其1個(gè)取精杯，在蓋子和容器上予以明確標(biāo)示。精子在交給工作人員時(shí)，要當(dāng)面取樣封管，簽字凍存，以備必要時(shí)的核查。實(shí)驗(yàn)員將患者的精液帶入實(shí)驗(yàn)室前核實(shí)患者的姓名及身份證號(hào)并記錄在院外取精協(xié)議書上。取精困難者，通知男科醫(yī)師?？咕涌贵w陽性者，應(yīng)在本中心的取精室取精后立即處理。二、精液分析：同前。三、精液處理方法：l、上游法：（1）男性血清抗精子抗體陰性者，待其精液液化后，取一滴作常規(guī)檢查并記錄，抗體陽性者，取后應(yīng)立即作洗滌處理或密度梯度離心。（2）精子分裝成約lml／管，2～多管，標(biāo)上病人的姓名，沿壁緩慢加入2～3ml的IVF—30液(已平衡好)以約30176。~45176。角傾斜放入37℃培養(yǎng)箱。（3）40~50分鐘后取出培養(yǎng)管，吸取上層液體(整個(gè)過程保持試管傾斜30176。~45176。，注意不攪動(dòng)下層液體)。（4）離心：1000～1500rpm5分鐘。（5）取出培養(yǎng)管后，去上清，加入1ml IVF—30培養(yǎng)液，以 30176。~45176。角傾斜放入C02培養(yǎng)箱，再次上游。（6）30分鐘后從培養(yǎng)箱中取出，吸取上層液體做精子計(jì)數(shù)及觀察活力。（7）106／ml待用。密度梯度離心法：（1）每份精液準(zhǔn)備1支15ml的尖底離心管，標(biāo)上Pureception和患者姓名，另準(zhǔn)備2支試管分別標(biāo)上Spermrinse 、IVF20和患者姓名。（2）將Pureception試劑盒在37℃預(yù)溫，在15ml的尖底離心管中分別加入等份量（~ ml）的80％(下層液)與40％(上層液)制成密度梯度離心液，將平衡過夜的Spermrinse 、IVF20分別抽取2 ml和1 ml置于相應(yīng)離心管內(nèi)。（3）將完全液化的精液沿內(nèi)管壁慢慢加入裝有Pureception密度梯度離心液的離心管中，2000rpm離心 10分鐘，棄去上清。（4）將沉淀移入Spermrinse管中，1500rpm 離心10分鐘，棄去上清。（5）將沉淀移入IVF20管中， 1500rpm離心10分鐘，棄去上清。 （6）保留底層沉淀，加入IVF20培養(yǎng)液至1ml，如沉淀少，~ ml，上游15~20分鐘。（7）將上層懸浮液移入標(biāo)有患者姓名的小試管中，106／ml待用。 注意：（1）處理精液樣本整個(gè)過程需無菌，并采取常規(guī)的防止感染的措施。（2）用吸管吸精液，檢查精液完全液化后再作上述操作。（3）在處理或檢查之前，精液樣本需充分混合均勻。由于粘稠度太大造成的不均勻，會(huì)引起精子活力和濃度結(jié)果不準(zhǔn)確。這種情況下，使用10ml注射器和18號(hào)針頭或吸管反復(fù)抽吸精液，使精液液化完全。（4）抗精子抗體為陽性的，洗滌二次后上游1次，第一次洗滌后離心轉(zhuǎn)數(shù)要大一些，約2000rpm。也可立即采用密度梯度離心法。（5）精子活力較差或密度較小的洗滌一次后上游一次即可。（6）樣本的拋棄：所有的體液標(biāo)本以及實(shí)驗(yàn)室棄物均應(yīng)按醫(yī)院廢物處理程度規(guī)定交醫(yī)院統(tǒng)一處理。（7）干擾物質(zhì)：污染的精杯可能會(huì)影響精子的活力。必須使用組織培養(yǎng)級(jí)并通過質(zhì)量檢測(cè)的精杯。一些藥物如鈣離子阻斷劑等，也會(huì)影響精子的活力。 參考文獻(xiàn)： 黃荷鳳主編，《現(xiàn)代輔助生育技術(shù)》，人民軍醫(yī)出版社，2003年9月第1版。 莊廣倫主編，《現(xiàn)代輔助生育技術(shù)》，人民衛(wèi)生出版社，2005年6月第1版。 葛秦生主編，《臨床生殖內(nèi)分泌學(xué)》，科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2001年版。 世界衛(wèi)生組織編，《WHO人類精液及精子宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》，人民衛(wèi)生出版社，2001年第4版生殖醫(yī)學(xué)中心規(guī)章制度一、生殖倫理委員會(huì)工作制度生殖倫理委員會(huì)（以下簡稱“本會(huì)”）是在醫(yī)院倫理委員會(huì)領(lǐng)導(dǎo)下，結(jié)合生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)特點(diǎn)，開展生殖倫理方面的咨詢、教育、培訓(xùn)；對(duì)實(shí)施中涉及的倫理問題進(jìn)行審查、論證和建議以及指導(dǎo)和監(jiān)督