臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理-資料下載頁
2025-08-05 01:52本頁面
【正文】 瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M行質(zhì)控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/~，殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。 最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳，這一點跟DNA分離相同。但如果對結(jié)果有疑問，就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體（28S18S和5S）在凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價的實驗室內(nèi)的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結(jié)論。 對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價標本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標本處理方法對擴增檢測的影響，避免由于標本處理方法的不當而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，還可采用已知濃度標本評價核酸提取方法的效果。 （2）逆轉(zhuǎn)錄和擴增：本部份包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控?！? 對逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標質(zhì)控方法也可采用外標質(zhì)控方法。逆轉(zhuǎn)錄擴增檢測的內(nèi)標通常為在整個細胞周期中均勻表達的mRNA，如HLA、 rRNA等。此外，也可在標本制備時將外來內(nèi)標加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴增。當標本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標即會表現(xiàn)為陰性結(jié)果?！? 對于DNA測定內(nèi)標可使用對有機體存活所必須的靶基因如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測，內(nèi)標多采用人工制備的競爭性內(nèi)標。內(nèi)標可以監(jiān)控每一擴增孔中假陰性的產(chǎn)生情況?！ ? 目前的商品試劑盒大部分沒采用內(nèi)標方法質(zhì)控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNAHCV RNA等時，應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測臨床標本等同處理提取核酸及擴增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴增檢測的效果?！?使用這些外加弱陽性質(zhì)控不但可檢測擴增反應液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質(zhì)控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相同的主反應混合液。 每一個PCR實驗中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控（污染監(jiān)測質(zhì)控），為判斷擴增過程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個過程中所帶的空白管、僅有擴增反應液但不含擴增模板的反應管、陰性標本等。陰性標本可以評估PCR實驗的綜合質(zhì)量?！ ? 在擴增靶RNA的RTPCR實驗中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴增的DNA片段所引起的污染。（3）板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯誤解釋。 （4）測定結(jié)果的評價與報告：采用實時熒光定量PCR檢測方法，在判斷結(jié)果時，應先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾。 結(jié)果的報告必須簡單清楚。定性測定報告陽性或陰性即可。定量測定則必須報告量的多少，如結(jié)果高于測定方法線性范圍上限，則對樣本稀釋后再測，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測定范圍下限，則報？多少即可，不能報告為0或陰性?！ ?室間質(zhì)量評價 所有開展臨床基因擴增檢驗的實驗室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的全國臨床基因擴增檢驗項目的室間質(zhì)量評價，評價結(jié)果將作為其開展臨床基因擴增檢驗的依據(jù)之一。
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