臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理-資料下載頁(yè)
2025-08-05 01:52本頁(yè)面
【正文】 瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見(jiàn)強(qiáng)的熒光信號(hào)。用對(duì)甲基化不敏感的限制性?xún)?nèi)切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測(cè)定來(lái)估計(jì)，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/~，殘留的蛋白或酚可能會(huì)很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對(duì)DNA的完整性下結(jié)論。 最快的對(duì)總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳，這一點(diǎn)跟DNA分離相同。但如果對(duì)結(jié)果有疑問(wèn)，就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體（28S18S和5S）在凝膠上出現(xiàn)的帶相對(duì)較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。測(cè)定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對(duì)RNA制備的質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)向低分子量拖尾的、不對(duì)稱(chēng)性的峰的評(píng)估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨(dú)的光度計(jì)比色方法也不能對(duì)RNA的完整性下結(jié)論。 對(duì)于血清（漿）中病毒的測(cè)定，則要評(píng)價(jià)標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，還可采用已知濃度標(biāo)本評(píng)價(jià)核酸提取方法的效果。 （2）逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：本部份包括陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控?！? 對(duì)逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增的質(zhì)控既可使用內(nèi)標(biāo)質(zhì)控方法也可采用外標(biāo)質(zhì)控方法。逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)通常為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的mRNA，如HLA、 rRNA等。此外，也可在標(biāo)本制備時(shí)將外來(lái)內(nèi)標(biāo)加入到樣本中共同提取、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會(huì)表現(xiàn)為陰性結(jié)果?！? 對(duì)于DNA測(cè)定內(nèi)標(biāo)可使用對(duì)有機(jī)體存活所必須的靶基因如維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因。對(duì)于病原體的基因檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)多采用人工制備的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)可以監(jiān)控每一擴(kuò)增孔中假陰性的產(chǎn)生情況。 目前的商品試劑盒大部分沒(méi)采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。因此在測(cè)定血清/血漿病原體核酸如HBV DNAHCV RNA等時(shí)，應(yīng)使用已知的弱陽(yáng)性血清/血漿作為質(zhì)控樣本，與待測(cè)臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴(kuò)增，以判斷逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增檢測(cè)的效果?！?使用這些外加弱陽(yáng)性質(zhì)控不但可檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測(cè)下限和特異性的信息。這些質(zhì)控樣本在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)必須使用與患者的標(biāo)本相同的主反應(yīng)混合液。 每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控（污染監(jiān)測(cè)質(zhì)控），為判斷擴(kuò)增過(guò)程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過(guò)程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。陰性標(biāo)本可以評(píng)估PCR實(shí)驗(yàn)的綜合質(zhì)量?！ ? 在擴(kuò)增靶RNA的RTPCR實(shí)驗(yàn)中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過(guò)這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。（3）板上雜交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。 （4）測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)與報(bào)告：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號(hào)對(duì)結(jié)果分析的干擾。 結(jié)果的報(bào)告必須簡(jiǎn)單清楚。定性測(cè)定報(bào)告陽(yáng)性或陰性即可。定量測(cè)定則必須報(bào)告量的多少，如結(jié)果高于測(cè)定方法線(xiàn)性范圍上限，則對(duì)樣本稀釋后再測(cè)，結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)；如結(jié)果低于方法的測(cè)定范圍下限，則報(bào)？多少即可，不能報(bào)告為0或陰性?！ ?室間質(zhì)量評(píng)價(jià) 所有開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的全國(guó)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果將作為其開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的依據(jù)之一。
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