【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 1. 臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn) 是判定細(xì)胞損傷的快速試驗(yàn)，它還可很方便進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。具體方法如下： ①取少量細(xì)胞混懸液，％臺(tái)盼藍(lán)溶液。 ②放置15min后，將混合液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi)。 ③顯微鏡下，細(xì)胞顯藍(lán)色的為死亡細(xì)胞，尤其是核深染，而未染的細(xì)胞為存活細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞總數(shù)后，可計(jì)算出細(xì)胞存活率。 2. 酶漏出的檢測(cè) 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測(cè)也與染料排斥試驗(yàn)有同樣的靈敏度，同時(shí)，可更精確地進(jìn)行定量，但操作時(shí)間較長(zhǎng)。 (1) 儀器：分光光度計(jì)，最好配有溫育(37℃)的裝置。 (2) 試劑： 溶液 ％NaCl，％％牛血清白蛋白。 底物 K2HPO4。配好后，可貯存于20℃的冰箱內(nèi)。 NADH，稱42mg，％NaHCO3，臨用前配制。 (3) 操作步驟：離心，以適當(dāng)速度使所有細(xì)胞沉淀而不引起細(xì)胞損傷。例如肝細(xì)胞用50g2min。取出上清，放人干凈試管，并保持0℃以下備用，加入等量的溶液至細(xì)胞沉淀，用漩渦混合器混合。保持在0℃以下，備用。 取一比色杯，加3ml底物，50μl的NADH和25~200μl的樣品(取決于培養(yǎng)細(xì)胞的種類)，迅速混合后，在340nm處進(jìn)行比色。整個(gè)過程應(yīng)在37℃條件下完成。計(jì)算上清或沉淀(即溶液中細(xì)胞)的LDH活性，漏出率表示方法為培養(yǎng)液中LDH活性占總的LDH活性的百分率。 3. 其它方法 鉻的釋放，利用51Cr3+可被活細(xì)胞吸收，并還原成51Cr3+，留在胞內(nèi)，而死亡細(xì)胞則釋放51Cr3+。用r計(jì)數(shù)器檢測(cè)無細(xì)胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。還有貼壁效率和ATP含量等指標(biāo)可鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。 (三) 細(xì)胞特性鑒定 在連續(xù)培養(yǎng)期間，細(xì)胞可能發(fā)生某些變化，如細(xì)胞與原始細(xì)胞的差異逐漸加大。但每一細(xì)胞株具有一系列細(xì)胞特性“正?！钡膮?shù)，可供鑒定評(píng)價(jià)。例如，形態(tài)學(xué)參數(shù)、生長(zhǎng)特性及染色體分析等皆為細(xì)胞特性鑒定的指標(biāo)，其中形態(tài)學(xué)與生長(zhǎng)特性的測(cè)定相對(duì)容易進(jìn)行。 1. 形態(tài)學(xué)檢查 評(píng)價(jià)細(xì)胞正常與否的最簡(jiǎn)單方法是形態(tài)學(xué)檢查；應(yīng)在每次傳代時(shí)用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，最好拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)。要詳細(xì)地描述每一細(xì)胞系的形態(tài)。若因限于篇幅，不能詳述，可掌握兩個(gè)述語，即“成纖維樣”和“上皮樣”細(xì)胞，即可描述所觀察的細(xì)胞。成纖維樣細(xì)胞系指在單層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的長(zhǎng)度要大于其寬度的兩倍的細(xì)胞，而上皮樣細(xì)胞系指呈多角形的細(xì)胞。 2. 生長(zhǎng)特性的檢查 在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其生長(zhǎng)特性的檢查較易進(jìn)行，主要通過測(cè)定更換培養(yǎng)液的時(shí)間和傳代的時(shí)間來完成。雖然不同的細(xì)胞其傳代時(shí)間和更換培養(yǎng)液的時(shí)間不同，但對(duì)于每一細(xì)胞系應(yīng)該較為固定，因?yàn)橹饕Q于細(xì)胞生長(zhǎng)速率。 每個(gè)細(xì)胞系均有其自己的生長(zhǎng)循環(huán)周期，這取決于接種進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目。一般認(rèn)為，在培養(yǎng)中的細(xì)胞，是處于不同的生長(zhǎng)階段。進(jìn)行生長(zhǎng)分析，應(yīng)觀察單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。在實(shí)際工作中，是測(cè)定克隆效率或者接種效率。克隆效率是測(cè)定由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的克隆。接種效率是測(cè)定植入小量細(xì)胞(2~50個(gè)／cm2)后，等生長(zhǎng)至可分辨的小克隆時(shí)，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水沖洗后，計(jì)算克隆數(shù)。接種效率= 一般認(rèn)為，傳代效率小于30表示生長(zhǎng)不正常。此項(xiàng)指標(biāo)可用于正常細(xì)胞生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)，貯存細(xì)胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。 在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，一般監(jiān)測(cè)指標(biāo)可采用形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)模式及接種效率即可。 3. 其它檢查 除上述指標(biāo)外，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可進(jìn)行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測(cè)定，來判斷培養(yǎng)細(xì)胞的特性。 七、細(xì)胞培養(yǎng)在食品毒理學(xué)中應(yīng)用 利用培養(yǎng)的細(xì)胞，可進(jìn)行多方面的毒理學(xué)研究，如表124中所列。表124 培養(yǎng)細(xì)胞用于毒理學(xué)體外實(shí)驗(yàn)的實(shí)例 一般毒性：主要為急性細(xì)胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細(xì)胞類型如肝細(xì)胞、腎近曲小管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞等： 毒作用機(jī)理 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測(cè)定 繁殖毒性 聯(lián)合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏毒性 以下重點(diǎn)討論毒理學(xué)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題。 1. 細(xì)胞類型的選擇 細(xì)胞類型的選擇取決于實(shí)驗(yàn)的目的。一般性篩選系列化合物的一般毒性時(shí)，應(yīng)選擇生長(zhǎng)迅速且易于處理的細(xì)胞系。機(jī)理研究多不用細(xì)胞系，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞會(huì)逐漸喪失許多功能，如細(xì)胞色素P450的活性。 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一是可選擇來源于人體的組織細(xì)胞，可減少試驗(yàn)結(jié)果的物種差異。成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞均可選用。常用的細(xì)胞系有CHO、V7Hela、BHR及L929等。 2. 代謝活化 細(xì)胞經(jīng)824h培養(yǎng)后，細(xì)胞色素P450活性將迅速下降。而在CHO細(xì)胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)需代謝活化的化學(xué)物不能夠敏感。 解決這個(gè)問題有兩個(gè)方法，一是加S9，二是與原代肝細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)。S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應(yīng)加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖6磷酸脫氫酶、葡萄糖6磷酸和NADP)。與原代肝細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)時(shí)也可采用其它不同的細(xì)胞系，如V7中國(guó)地鼠肺成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。 3. 受試物的給予許多 受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞有損害作用，故應(yīng)限制有機(jī)溶劑濃度在1％以下。在試驗(yàn)中可設(shè)立適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑對(duì)照和培養(yǎng)液對(duì)照。例如，需用S9混合液；％，因?yàn)樵S多有機(jī)溶劑可抑制酶的活性。不溶性的受試物如，顆粒和油劑在給予培養(yǎng)液時(shí)仍存在問題。一般是混懸于培養(yǎng)液或者先溶于溶劑，再加人培養(yǎng)液，但有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的毒性結(jié)果。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時(shí)將有某些塑料培養(yǎng)皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 設(shè)立陽性對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重現(xiàn)性應(yīng)該用陽性對(duì)照物來檢查。陽性對(duì)照物指采用經(jīng)過研究或公認(rèn)有特定作用的化學(xué)物。例如在代謝活化研究中常選擇環(huán)磷酰胺為陽性對(duì)照物，在細(xì)胞毒性篩檢時(shí)可選二甲基環(huán)己基烴乙基戊二酰亞胺和二硝基苯酚為陽性對(duì)照物。 5. 毒性指標(biāo)的選擇 依據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康暮驮囼?yàn)條件，可選擇不同的觀察指標(biāo)。下列指標(biāo)在毒理學(xué)中經(jīng)常采用： (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長(zhǎng)速率減至對(duì)照組一半時(shí)所需受試物的濃度生長(zhǎng)速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細(xì)胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評(píng)價(jià)細(xì)胞特性的指標(biāo)，如形態(tài)學(xué)和接種效率等，均可采用。 (2) 細(xì)胞膜損傷：可選擇臺(tái)盼藍(lán)攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標(biāo)來評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的損傷。 (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗(yàn)和[3H]尿嘧啶參入RNA試驗(yàn)等指標(biāo)，以判斷受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的大分子合成與降解的有無作用。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標(biāo)外，還有毒物代謝酶的活性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用及[14C]葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細(xì)胞的代謝能力。 (5) 形態(tài)學(xué)觀察：通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。 第三節(jié) 亞細(xì)胞組分制備及其檢測(cè)方法 細(xì)胞由許多亞細(xì)胞組分組成，如核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體及高爾基氏體等，它們?cè)诰S持細(xì)胞正常生理功能方面起著重要的作用。故許多外源化學(xué)物引起機(jī)體的損害作用，有可能與亞細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)與功能損傷有關(guān)。在毒理學(xué)中，亞細(xì)胞組分作為遺傳毒性測(cè)定中的代謝活化系統(tǒng)，如S9已普遍運(yùn)用。此外，亞細(xì)胞組分主要用于中毒機(jī)理的分子水平研究，因它們是從整體細(xì)胞上在自然環(huán)境下分離出來的，使毒理學(xué)家在體外條件下，有可能更深入了解外源化學(xué)物在毒作用部位的作用機(jī)理。但它離開子整體細(xì)胞，也有其局限性；即它僅提供有關(guān)一些特殊作用能力的特定信息。對(duì)外源化學(xué)物毒作用機(jī)理研究，還應(yīng)結(jié)合其它研究如整體試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)等，綜合作出評(píng)價(jià)?，F(xiàn)就微粒體和線粒體的制備及其檢測(cè)方法加以介紹。 一、基本技術(shù) (一) 設(shè)備 1. 勻漿器(homogenizer) 常用勻漿器為Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管組成。它是利用兩者的間隙將細(xì)胞破碎，~。杵是由馬達(dá)傳動(dòng)，其速度在2000rpm以內(nèi)，且可調(diào)節(jié)。它較適合肝細(xì)胞、腎細(xì)胞及腦細(xì)胞的破碎，而對(duì)肺、甲狀腺等結(jié)締組織較多的組織效果不佳。勻漿器可從5ml至50ml大小不等，依實(shí)驗(yàn)需要加以選擇。使用本法破碎細(xì)胞應(yīng)注意：①在低溫下操作避免勻漿磨擦生熱和室溫影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；②馬達(dá)速度不宜過快，慢速可獲更大的扭力矩；③勻漿上下次數(shù)，即杵由玻璃套管上部下到底部，再回到上部，一般肝細(xì)胞勻漿上下8~10次即可達(dá)到破碎目的。 2. 離心機(jī) 是亞細(xì)胞組分制備的關(guān)鍵設(shè)備，一般需要低溫高速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為18 000～24000rpm，和超速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。離心機(jī)應(yīng)配備各種類型的轉(zhuǎn)頭，以供亞細(xì)胞組分制備時(shí)差速離心選用。離心管最好為聚丙烯的，因其透明性較好。 (二) 勻漿介質(zhì)和緩沖液 最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(／L)和氯化鉀(／L)。蔗糖為經(jīng)典亞細(xì)胞組分分離研究所選用，而氯化鉀更適合外源化學(xué)物代謝酶的研究，如它可更有效除去微粒體制備物中的血紅蛋白，減少光譜測(cè)定的干擾。勻漿緩沖液可含有5~50mmol／L的Tris或Hepes。 ／L KCl的50mmol／L TrisHCI緩沖液。此緩沖液在4℃條件下，至少貯存12周不變質(zhì)。 (三) 生物樣品 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應(yīng)迅速處死，常用的方法是斷頭處死。應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。對(duì)于大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如狗等，應(yīng)在適當(dāng)?shù)穆樽項(xiàng)l件下，放血處死。盡快取出所需臟器，如肝、腎、肺及腦等，置人冰的勻漿介質(zhì)中。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)參考動(dòng)物的年齡、性別、品系、健康狀況、飲食類型和飼養(yǎng)環(huán)境等因素。此外，為避免晝夜節(jié)律影響，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)在相同時(shí)間處死動(dòng)物。為避免肝糖原影響，大鼠應(yīng)禁食過夜。 (四) 微粒體酶的誘導(dǎo)方法 1. 苯巴比妥鈉 它是常用的誘導(dǎo)劑之一。其方法是以小鼠80mg／(kgd)，大鼠100mg／(kgd)，經(jīng)腹腔注射或與生理鹽水混合灌胃，連續(xù)3~5天即可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450的活力。還可以將藥溶于飲水，1ng／ml，大約7天后，可達(dá)到誘導(dǎo)效果。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450。 2. p萘黃酮(βnaphthoflavone) 它是多環(huán)芳烴類的誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448，同類誘導(dǎo)物還有3甲基膽葸(3methylcholanthrene)。β萘黃酮的使用方法是小鼠40mg／(kgd)，大鼠80mg／(kgd)，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)3～4天，即可達(dá)到誘導(dǎo)作用。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448。 3. 多氯聯(lián)苯 常用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)物是Arochlorl254，它是混合型的誘導(dǎo)物，即同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450和細(xì)胞色素P448，劑量依多氯聯(lián)苯種類不同而異，需做預(yù)試驗(yàn)來確定。 二、微粒體的制備 微粒體(microsome)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨(dú)立的細(xì)胞器。由于微粒體含有混合功能氧化酶，其在毒理學(xué)研究中有著重要地位，故微粒體是毒理學(xué)中較常用的體外系統(tǒng)。 (一) 肝微粒體制備 1. 以斷頭方法處死動(dòng)物，迅速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水或勻漿介質(zhì)洗凈血污，剪去粘連的組織，用濾紙輕輕吸干表面水分，稱重。 2. 將肝轉(zhuǎn)入小燒杯，用剪刀剪碎肝臟，加入適當(dāng)勻漿介質(zhì)，一般為3ml／g肝臟。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。 3. 按示意圖操作離心。 肝勻槳離心，10000g 20 min 上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去在第一次離心去除線粒體、核等物質(zhì)時(shí)，離心管上層漂浮有脂質(zhì)層，應(yīng)用吸管將其除去，再收集上清液。在第二次超速離心后，如為了減少血紅蛋白的影響，可加勻漿介質(zhì)將沉淀重新懸浮，將所制備的微粒體再洗滌一次。沉淀即微粒體，懸浮于10mmol／L HepesHCl緩沖液，／L KCl，l mmol／LEDTA和20％甘油，貯存于20～70℃或是液氮中。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是貯存方式和時(shí)間對(duì)微粒體酶的活性或特征會(huì)有不同程度的影響。 4. 其它方法 除超速離心法制備微粒體外，還有凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法也可以制得微粒體。凝膠過濾法不適于做多個(gè)樣品。鈣沉淀法適于沒有超速離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)室使用。其方法是在去線粒體的上清液中加入鈣離子，使其終濃度為8mmol／L CaCl2，此時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分產(chǎn)生鈣依賴性聚集，在較低的離心條件，2000~25 000g，20min即可將其沉淀。不足之處是鈣離子可影響某些酶的活性以及造成核糖體的丟失。等電點(diǎn)沉淀法是利用pH改變，使微粒體沉淀出來，在較低離心條件下，10000g l0min，即可制得微粒體。其優(yōu)點(diǎn)也是不需超速離心機(jī)，不足之處是酸性條件下，可使某些酶和CytP450失活。 (二) 肝外組織微粒體的制備 肝微粒體制備過程中的一般性規(guī)則對(duì)于肝外組織同樣適用。對(duì)于較軟的臟器，如腎臟、睪丸和腦與肝微粒體制備的操作變動(dòng)不大。對(duì)于結(jié)締組織較多的肺、皮膚等臟器和對(duì)于小腸微粒體的制備較為麻煩。因?yàn)?，小腸僅上皮細(xì)胞含有外源化學(xué)物的代謝酶，在小腸的