【正文】 常后，加入少量連二亞硫酸鈉固體，使記錄筆迅速下移。數(shù)分鐘后，記錄筆穩(wěn)定在較低的位置。此時，緩沖液為無氧狀態(tài)，筆處的位置為“氮氣線”。通常，氮氣線是位于記錄儀調(diào)試時的記錄零點，此時電極電壓為零“氮氣線”與“空氣線”位置之差表示緩沖液的氧濃度。 3. 線粒體呼吸的測定 (1 ) ，約含蛋白4mg，進入電極室，注意排除空氣，調(diào)正電極位置。封閉電極室后，使線粒體唯一的氧源是呼吸緩沖液中的溶解氣體。 (2) 在不改變緩沖液氧濃度的情況下，向電極室加人不同的試劑，其理想辦法是用微量注射器，并且每次加入量不超過20μl。加試劑時，應小心緩慢，不要引起記錄筆的“跳動”。 (3) 加入不同代謝物后，線粒體的代謝狀況見表125。表中所示，加人代謝物濃度不一，會引起呼吸速率的改變，其速率限制因素也不一。實驗中主要觀察狀態(tài)狀態(tài)4，以計算呼吸調(diào)控比(respiratory control ratio，RCR)。 (4) RCR的計算： 記錄內(nèi)源性呼吸2min，即狀態(tài)1。加底物S或P+M，激發(fā)呼吸，使線粒體進入狀態(tài)4； 記錄23min后，加入已知量的ADP，激發(fā)線粒體呼吸進入狀態(tài)3。當ADP消耗完后，呼吸又回到狀態(tài)4。計算RCR的狀態(tài)4應是加ADP后出現(xiàn)的狀態(tài)4，因為起始的狀態(tài)4總是要比加ADP后出現(xiàn)的狀態(tài)4慢。 狀態(tài)3或4的呼吸速率計算：已知呼吸緩沖液的氧濃度為420ng atom O／min，總氧含量為840ng atom，記錄范圍即空氣線至氮氣線為95％，故將總氧含量垂直分為95等分， O。通過記錄筆的移動，縱軸為氧耗，橫軸為時間，可求出呼吸速率。一般琥珀酸為底物，狀態(tài)3的呼吸速率為94ng atom O／(mg蛋白min)，狀態(tài)4為23ng atom O／(mg蛋白min)；而丙酮酸加蘋果酸為底物，狀態(tài)3的呼吸速率為5lng atom O／(mg蛋白min)，狀態(tài)4為l0ng atom O／(mg蛋白min)。故琥珀酸的PCR為4，丙酮酸加蘋果酸約為RCR為5。如果RCR3，可認為制備的線粒體失敗。 4. ADP／O比值測定 在生物化學上，P／O比指磷酸化與呼吸之間的化學計算關(guān)系，常用Warburg壓力計來測定。此外，依據(jù)P／O比也等于ADP／O比，利用線粒體呼吸測定試驗可求出ADP／O比。ADP的加入量是已知，加入后線粒體的氧耗量，可通過圖WX中的X求得。故可計算出ADP／O比。ADP／O比值取決于線粒體的制備情況，ADP加入量及O2濃度測定的精確性，它是判斷線粒體功能是否完好的指標之一。 (二) 線粒體呼吸的抑制作用研究 研究線粒體呼吸的抑制作用，在了解線粒體氧化磷酸化作用中起著重要的作用。外源化學物抑制線粒體的氧化磷酸化過程，將它們的抑制作用研究與已知抑制劑作用比較，可探討外源化學物作用線粒體氧化磷酸化的機理。 1. 分類 常見線粒體抑制劑的分類見表126。表125 線粒體的代謝狀況 代謝物濃度狀態(tài) 呼吸速率 速率限制因素 O2 ADP 底物1 高 低 低 慢 ADP水平2 高 高 無 慢 底物水平3 高 高 高 快 呼 吸 鏈 4 高 低 高 慢 ADP水平 5 無 高 高 無 氧 水 平表126 線粒體抑制劑的分類 類 型 代表性抑制劑 呼吸鏈抑制 部位I 魚藤酮 部位Ⅱ 抗霉素A 部位Ⅲ 氟化鉀 解偶聯(lián)劑 CCCP或DNP ATP酶／合成酶抑制 寡霉素 底物轉(zhuǎn)運 丁基丙二酸(二羧酸轉(zhuǎn)運) 離子轉(zhuǎn)運 鈣紅(Ca2+轉(zhuǎn)運)表127 ATP合成測定的加樣方案 測定項目 緩沖液 糖激酶 線粒體制備物 H2O 底 物 空 白 1ml 20μl 50μl 30μl — 對 照 1ml 20μl 50μl 30μl 10μl 測 定 1ml 20μl 50μl 2. 經(jīng)典抑制作用 經(jīng)典抑制作用見圖126。 對AE模式的解釋如下： (A) 魚藤酮(Rot)可抑制NADH連接底物的線粒體呼吸。加入底物琥珀酸(S)可刺激呼吸，是因為琥珀酸可繞過魚藤酮的抑制阻礙進入呼吸鏈。再加抗霉素A(Anti—A)可阻斷琥珀酸以后的呼吸鏈。加入四甲基—對苯胺二胺／抗壞血酸(TMPD／ascorb)，它們是人工的電子供體，故可將電子輸入抗霉素A，刺激線粒體呼吸，如加氰化鉀(CN)可阻斷由TMPD／ascorb刺激的呼吸。 (B) 曲線的上半部分是典型的狀態(tài)3向狀態(tài)4過渡的軌跡。當加入蒼術(shù)苷(AF4)，不影響狀態(tài)4。ADP作為阻斷ADP／ATP易位子的抑制劑也無作用。然而，加人一解偶聯(lián)劑，仍可像正常一樣，刺激線粒體呼吸，表明假如有抑制劑已經(jīng)作用于呼吸鏈，則解偶聯(lián)劑不可能刺激線粒體的呼吸。 (C) 用寡霉素(Oligo)可出現(xiàn)同B一樣的軌跡，它的作用機理可能是對ATP酶／合成酶復合物起抑制作用，表明兩種不同類型的抑制劑可產(chǎn)生對呼吸的相同作用。需用其它實驗加以區(qū)別。 (O／E)這兩種曲線，均表現(xiàn)Ca2+可刺激線粒體的呼吸，而鈣組(R．R)可抑制Ca2+刺激的呼吸。因為它是一種Ca2+轉(zhuǎn)運的特殊抑制劑。 由前述可知，用氧電極研究可獲得許多有關(guān)外源化學物對線粒體作用的資料。本研究應注意的是：①加人多種抑制劑，應保證兩次實驗之間，徹底清洗電極室；②對于不溶于水的受試物，應設立溶劑對照，觀察溶劑是否對線粒體有作用。在每次實驗結(jié)束，均應用乙醇洗去受試物的任何軌跡，再進行下次實驗。 (三) ATP合成的測定 測定線粒體氧化磷酸化除氧化電極外，還有另一種方法，即測定ATP合成量。常用的方法是用葡萄糖／己糖激酶捕捉系統(tǒng)，其中由ATP不斷產(chǎn)生ADP，使線粒體維持狀態(tài)，通過Pi的消失測定ATP的形成。本法簡便易行，又不需特殊的儀器。此外，由于線粒體制備物可保持良好的偶聯(lián)狀態(tài)，一般為2～3h，可進行許多測定，尤其是抑制作用的研究。再者，ATP合成的測定，不同于偶聯(lián)的氧消耗，受線粒體制備的質(zhì)量影響較小。 1. 試劑 (1) ATP合成緩沖液：l0mmol／L Tris HCl緩沖液，／L蔗糖，22mmol／L葡萄糖，5mmol／L磷酸二氫鉀，2mmol／L MgCl2，2mmol／L ADP等。 (2) 己糖激酶，／L蔗糖，10mmol／LTrisHCI緩沖液，／20μl的溶液。 (3) 磷酸測定：10％三氯醋酸(TCA)，Pi儲備液，3mmol／L KH2PO4，／L H2SO4為溶劑；ANSA試劑，7H20溶于250ml蒸餾水。避光，冷藏保存。 2. 方法 關(guān)鍵是反應混合物要不斷充氣。一般用恒溫水浴搖床即可滿足要求，其速度為90轉(zhuǎn)／min。用閃爍瓶或小的細頸瓶作反應容具。 (1) 如表所示步驟加入各試劑后，在30℃恒溫水浴溫育5min，加入琥珀酸或丙酮酸+蘋果酸為底物，繼續(xù)溫育。 表128 AW合成測定的加樣方案 測定項目 緩沖液 糖激酶 線粒體制備物 H2O 底物 空 白 1ml 20μl 50μl 30μl — 對 照 1ml 20μl 50μl 30μl 10μl 測 定 1ml 20μl 50μl (2) 10min后終止反應，取20μl進一小塑料管，再加200μl 10％TCA，混勻，離心5min． (3) 取100μl上清液加人一試管中，再加3ml蒸餾水，充分混勻，混勻，10min后，在750nm處測定其光密度，通過標準曲線(0～／LPi)，計算出Pi的含量。 在對照或測定管與空白管中Pi含量的差值，即為Pi轉(zhuǎn)變或ATP的量。結(jié)果表示: nmolATP／(mg蛋白min)。對于肝臟線粒體底物琥珀酸或丙酮酸加蘋果酸的正常值分別為300和100nmolATP／(mg蛋白min)。 第四節(jié) 生物膜的制備與其性質(zhì)的研究方法 一、大鼠肝細胞膜的制備 其基本原理是將肝組織在含有Ca2+離子的低滲碳酸氫鈉緩沖液中溫和勻漿，使細胞膜保持較大的膜片；其次，應用低速離心使細胞膜片與細胞核一起從勻漿中分離，再利用細胞膜與細胞核之間的密度差異，用密度梯度離心將細胞膜從低速離心獲得的粗核部分中分離出來。(一) 試劑 含有1．0mmol／L NaHCO3的緩沖液，；／L ／L NaHCO3緩沖液；蔗糖溶液濃度分別為70％，45％，41％和37％，％NaCl溶液。(二) 儀器設備制備型超速離心機，Potter勻漿器(三) 操作步驟將大鼠禁食1224h后，斷頭處死，盡量放干凈血液，迅速取出肝臟，隨即用預冷的生理鹽水洗滌數(shù)次，盡量除去殘留的血液。稱重、剪碎，／，／LCaCl2(簡稱緩沖液A)內(nèi)進行勻漿，肝勻漿濃度為10％。然后，用緩沖液A將勻漿稀釋10倍，攪拌、靜置。經(jīng)雙層尼龍布過濾后，按圖所示操作(04℃下進行)。 在差速離心分離所得的沉淀中，加入70％(W／W)的蔗糖溶液，轉(zhuǎn)移至超速離心管中。在其上依次鋪加45％(W／W)、41％(W／W)和37％(W／W)的蔗糖溶液，形成不連續(xù)的蔗糖密度梯度。在超速離心100000g，120min。超速離心結(jié)束后，收集41％與37％蔗糖溶液界面的致密沉淀。／L碳酸氫鈉緩沖液，洗滌，以除去蔗糖，即獲得肝細胞膜制備物。 (四) 鑒定 應用最廣泛的是利用膜上酶的活力，作為標志來鑒定膜的分離情況。肝細胞膜的標志酶有5’核苷酶、Na+、K+—ATPase等，測定方便，無需大型儀器。但它的不足之處是這些酶在質(zhì)膜上并不總是均勻的，據(jù)之作出判斷有一定的局限性。還有膜上的其它蛋白如膜抗原、激素受體及外源凝集素受體等可供利用鑒定膜的分離情況。此外，還可用放射性核素化學物、熒光試劑和順磁試劑等對肝細胞進行共價標記，以跟蹤肝細胞膜在分離時的去向。但在使用時尚有一些問題，如共價標記有時會改變膜的天然性質(zhì)，小分子標記物可進入細胞內(nèi)或吞噬入細胞等。 二、紅細胞膜的制備紅細胞取材方便，結(jié)構(gòu)簡單，均一性好。人紅細胞去除血紅蛋白后即得血影，即紅細胞膜。研究紅細胞膜時有三種模式系統(tǒng)可供選擇：洗滌過的完整紅細胞膜再封血影(resealed ghost)及封閉的紅細胞膜囊泡。 (一) 紅細胞膜 常用的制備方法是在低滲條件下脹破紅細胞，離心20000g。洗滌去除血紅蛋白，即獲紅細胞膜。此種膜最接近整體系統(tǒng)(in vivo)，但它不能控制細胞質(zhì)內(nèi)的環(huán)境；在應用上有一定的局限性。此外，低滲制備的紅細胞膜雖然去除了細胞內(nèi)質(zhì)，但膜的封閉性差；有許多泄漏的空穴。 (二) 再封血影 近年來發(fā)現(xiàn)在一定條件下，脹破了的紅細胞可以重新封閉，對K+等離子不通透，給研究紅細胞膜提供了一模式。其制備的方法有： 1. 血影的低滲液中加入濃鹽溶液，成為等滲溶液，置于37％溫育20min，期間可緩慢地攪拌3次，可得一定比例的再封血影。 2. 將低滲脹破的紅細胞在0℃條件下，過BiogdA柱，柱上的1／，以利膜與血紅蛋白分離，下2／，有利于隨后紅細胞空泡的重新封閉，當膜從柱上流出后即用3Mol／L KCl。調(diào)節(jié)為等滲液，即150mmol／L KCI濃度。在37℃溫育l h，即獲得重新封閉血影。 (三) 封閉的紅細胞膜囊泡 有