【正文】 細(xì)胞膜脂流動性的影響、對細(xì)胞膜相變溫度的影響、脂質(zhì)過氧化效應(yīng)、胞內(nèi)鈣濃度變化及形態(tài)學(xué)改變等，這對鉛的腎臟毒性機(jī)理提供了依據(jù)。據(jù)報道此株系細(xì)胞的各種生物學(xué)特征已進(jìn)行了相當(dāng)深入的研究(包括激素應(yīng)答反應(yīng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運特征、細(xì)胞的代謝功能和標(biāo)志等)。 1. 腎細(xì)胞 由于腎小管，尤其是腎近曲管是腎臟重要的功能單位，目前已經(jīng)建立了幾種腎近曲管細(xì)胞株系用于毒理學(xué)研究。 (四) 細(xì)胞培養(yǎng) 有些臟器細(xì)胞建立了傳代培養(yǎng)技術(shù)，建成有穩(wěn)定遺傳特征的細(xì)胞株系。當(dāng)在培養(yǎng)液中加入10μmol／L氯化鎘之后，B型通道開放時間縮短1／％、通道開放概率下降55％，％、％、通道開放概率下降50％，而對T型通道無影響。經(jīng)記錄、分析各心肌細(xì)胞動作電位參數(shù)，結(jié)果鎘在5～20μmol／L濃度下，可使心肌細(xì)胞動作電位及最大除極速率顯著降低，表明鎘對心肌有直接的毒性效應(yīng)。 5. 心肌細(xì)胞 心肌細(xì)胞用于毒理學(xué)研究的報道目前還較少。 4. 腦細(xì)胞 分離的新鮮腦細(xì)胞有助于研究外源化學(xué)物對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的評價與探討其機(jī)理如用小鼠大腦皮質(zhì)分離、溫育后，研究二價陽離子鈣、鎂、鋅、鎘等對皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)現(xiàn)這些離子隨著濃度的增加，腦神經(jīng)細(xì)胞的電泳遷移率逐漸減慢。 3. 淋巴細(xì)胞 多用小動脈脾臟分離淋巴細(xì)胞或進(jìn)一步分離T、B淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫毒理研究。巨噬細(xì)胞可以用于多種體外試驗，例如利用巨噬細(xì)胞的免疫功能檢測外源化學(xué)物的免疫毒性，又如利用巨噬細(xì)胞檢測以肺臟為毒理學(xué)終點的外源化學(xué)物的中毒毒性和機(jī)理。在體外試驗表現(xiàn)毒性較低的化學(xué)物有環(huán)已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和長春新堿(vincristine)等。如研究化學(xué)物的肝臟毒性，一般認(rèn)為，用原代肝細(xì)胞培養(yǎng)篩檢與鑒定是否化學(xué)物具有肝臟毒性較為可靠，與體內(nèi)試驗相符合。據(jù)報道人肝細(xì)胞中CytP450活性穩(wěn)定性比大鼠強(qiáng)。肝細(xì)胞原代培養(yǎng)期間細(xì)胞不分裂、不增殖，但發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄是存在的(培養(yǎng)初期24h在1％或以上)。不足之處是切片內(nèi)的細(xì)胞易于缺氧，且受試物也不易均勻到達(dá)細(xì)胞內(nèi)。不同研究期間有別，如肝切片研究CytP450不應(yīng)超過8h，腦切片一般在6h左右。例如，腦片和心肌條等是將組織片置于恒溫的孵育液中進(jìn)行有關(guān)試驗研究，但需注意切片中的細(xì)胞需保持完好的細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞之間的交流。這種標(biāo)本可用在研究神經(jīng)毒物對神經(jīng)傳導(dǎo)功能的損傷及強(qiáng)度。例如有人研究鋅的吸收及其影響因素，以大鼠回腸段為標(biāo)本，證實鋅吸收呈二室模型(腸腔為Ⅰ室、腸粘膜為Ⅱ室)，苯丙氨酸能增加腸腔與腸粘膜之間鋅的交換，且加速向血流的清除過程。 2. 腸灌流 利用某一部分小腸體外灌流可以研究一些化合物的吸收及動力學(xué)過程。有報道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氫取代衍生物三氯甲烷與二氯甲烷對肝臟毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著灌流時間延長(在4h之內(nèi))，灌流液的上清液中K+、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SCPT)、山梨醇脫氫酶(SDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)增加，說明三種化合物對肝細(xì)胞均有損傷，而以四氯化碳為最，且依氯原子被氫取代肝毒減低。在灌流液中加入外源化學(xué)物，此外要維持灌流液的pH值、氧含量，還要控制適宜的灌流液流速。因為，慢性毒性病理過程的機(jī)理所知甚少，缺乏發(fā)展體外試驗的理論依據(jù)，再者，某些體外系統(tǒng)仍難以達(dá)到長期維持生理狀態(tài)的要求。但現(xiàn)階段毒理學(xué)作為一個學(xué)科的發(fā)展尚缺少許多重要的資料。另一方面，體外毒性試驗中缺乏毒理學(xué)反應(yīng)的調(diào)控因素，如細(xì)胞與組織的修復(fù)過程和免疫系統(tǒng)的不同類型細(xì)胞間的相互影響等。體外試驗是依據(jù)毒性作用的始發(fā)階段及繼續(xù)發(fā)生的分子與細(xì)胞反應(yīng)，其與整體系統(tǒng)有差異，如何將產(chǎn)生體外毒性的體外濃度與相應(yīng)體內(nèi)劑量聯(lián)系的問題是最終未解決的難題。在體外試驗中，利用人體細(xì)胞組織進(jìn)行試驗，可較好地解決物種差異的問題。在毒理學(xué)整體試驗中禁止直接進(jìn)行人體試驗。體外毒性試驗結(jié)果可迅速得出，將減少了解新化學(xué)物毒理學(xué)資料所需的時間，最終可以縮短從新化學(xué)物的合成到產(chǎn)品進(jìn)人市場的時間過程。 (三) 體外試驗的優(yōu)缺點 體外毒性試驗的優(yōu)點可歸納在表12—1。如將敏感細(xì)胞或某分子靶部位例如酶，在體外條件下，維持其正常的生理功能，并觀察外源化學(xué)物對其的影響，即將毒理學(xué)中毒物中毒的啟動階段，在體外條件下，觀察其對外源化合物的反應(yīng)和外源化學(xué)物對它的作用。它是在大量實驗的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗?zāi)芴娲w動物試驗，以提供更多的信息。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機(jī)理的研究，但僅有它是不夠充分的。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進(jìn)行更權(quán)威的試驗，無論是整體還是體外試驗。了解體外毒性試驗在上述毒理學(xué)決策過程中有何意義，對于評價體外毒性試驗在毒理學(xué)中的地位極有幫助。在有些情況下，是要決定一種化學(xué)物在所預(yù)期的條件下使用是否安全，如新藥物開發(fā)即需要這一評價。但也需指出，體外試驗的發(fā)展，并不排斥體內(nèi)試驗本身的重要性，兩者必須相互補(bǔ)充、相互驗證才能為毒理學(xué)研究提供堅實的科學(xué)基礎(chǔ)。④更重要的是由于生物技術(shù)的巨大進(jìn)步，不僅表現(xiàn)在細(xì)胞組織及器官培養(yǎng)領(lǐng)域，而且在生物分子技術(shù)方面，也為毒性試驗和研究提供了新的方法和工具。②現(xiàn)有的整體動物毒性試驗方法需消耗大量的時間和昂貴的經(jīng)費，而體外試驗則可節(jié)省時間和經(jīng)費。在此種情況下，利用經(jīng)典的整體動物試驗取得完整的毒理學(xué)資料極為困難。目前，此種觀點已發(fā)生變化，因為：①全世界每年約有千種以上的新化合物作為商品進(jìn)入人類的環(huán)境。體外試驗?zāi)Ｐ?in vitro test)在上述過程中也起著重要的作用，尤其是機(jī)理研究方面。 第一章 體外試驗與生物新技術(shù) 在毒理學(xué)中的應(yīng)用第一節(jié) 體外試驗 毒性試驗的目的在于獲取一定的數(shù)據(jù)，為社會需要的外源化學(xué)物的安全使用做出判斷。過去利用整體實驗動物模型或稱體內(nèi)試驗(in vivo test)模型所提供的資料，判斷外源化學(xué)物及其制品和混合物等對人類健康是否具有損害作用。但是，在毒理學(xué)研究中整體試驗研究的觀點仍占主導(dǎo)地位。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當(dāng)數(shù)量沒有進(jìn)行必要的毒理學(xué)評價。解決此種問題的重要方向是體外試驗。③動物保護(hù)主義運動的興起，要求盡量減少動物的使用，而且應(yīng)當(dāng)盡量減少痛苦地處理動物。所以體外試驗在毒理學(xué)研究中所占的地位日趨重要，甚至有占主導(dǎo)地位的趨勢。 一、概述 (一) 分類 毒性試驗的目的是提供一些適當(dāng)?shù)馁Y料，以便確定有關(guān)化學(xué)物的毒理學(xué)性質(zhì)。在有些情況下，例如新工業(yè)品或日用化學(xué)品的開發(fā)，必須決定一種新化學(xué)物的接觸安全限量?？梢罁?jù)體外試驗在決策過程中所起的作用將其分為3類：①篩選試驗。②附加試驗。③替代試驗。 (二) 基本原理 體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和／或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細(xì)胞上或敏感細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果?；谏鲜鲈恚w外試驗?zāi)Ｐ腿〔姆秶軐?，可取哺乳動物的離體臟器灌流、臟器切片溫育、細(xì)胞培養(yǎng)、亞細(xì)胞器組份以及提純的某些酶分子或DNA分子等等。表121 體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)點能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細(xì)胞，細(xì)胞器等試驗間的誤差較少可同時和／或反復(fù)多次取樣可做成復(fù)雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)等較為快速和經(jīng)濟(jì)需要較小量的受試化合物產(chǎn)生較小量的有毒廢物可以利用人體細(xì)胞減少整體動物的使用 其中特別值得一提的優(yōu)點是體外試驗的簡便和易于利用人體細(xì)胞。此外，對鑒定毒理學(xué)資料有問題的新化學(xué)物，可及時終止開發(fā)，減少由資源到產(chǎn)品的投入。但毒理學(xué)試驗的目的是關(guān)心人類健康，目前主要是將動物試驗結(jié)果外推至人類，物種間差異為其不確定因素之一。 體外毒性試驗系統(tǒng)的利用在目前尚有不足之處：①體外到體內(nèi)外推的問題。它需要更好的工具——預(yù)測性毒物代謝動力學(xué)來解決，其關(guān)鍵在于發(fā)展有生理學(xué)基礎(chǔ)的毒物代謝動力學(xué)模型。假如有了更全面的毒理學(xué)過程的基礎(chǔ)知識，可設(shè)計更符合整體動物模型的體外系統(tǒng)。②體外毒性試驗難以預(yù)測慢性毒性。 二、體外試驗系統(tǒng) (一) 臟器灌流 1. 肝臟灌流 是毒理學(xué)中研究外源化合物對肝臟損傷及代謝的常見方法。一般是以下腔靜脈和門靜脈為插管灌流通路，為此應(yīng)結(jié)扎肝動脈、上腔靜脈，在恒溫條件下灌流。需指出肝灌流時間不能過久，以4h之內(nèi)為宜，否則肝細(xì)胞的功能與生存不能維持。如用大鼠，則在麻醉下切腹分離一段小腸，在保持原有血液循環(huán)體系下，將腸兩端插管，清洗凈腸中內(nèi)容物，在恒溫環(huán)境中灌入灌流液。 3. 膈肌膈神經(jīng)標(biāo)本 取完整的大鼠膈肌膈神經(jīng)置于恒溫灌流液中，在幾小時之內(nèi)可維持基本正常的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。 (二) 臟器切片 肝臟、腎臟、腦部及心均可以制備切片。切片厚度一般在250μm。此系統(tǒng)的優(yōu)點是保持了細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)，其操作也比臟器灌流容易。 (三) 原代細(xì)胞培養(yǎng) 1. 肝細(xì)胞原代培養(yǎng) 肝細(xì)胞尚未建成傳代的細(xì)胞株系，多用原代培養(yǎng)。細(xì)胞原代培養(yǎng)維持生存期1～2周，但是CytP450卻在24～28h活性減少50％左右。 利用原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞可以進(jìn)行多種毒理學(xué)研究。有報道以肝細(xì)胞損傷后某些酶釋放為指征，研究30個化學(xué)物，結(jié)果除少數(shù)化學(xué)物在肝細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)毒性比體內(nèi)試驗低之外，多數(shù)化學(xué)物內(nèi)外毒性符合一致。 2. 巨噬細(xì)胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法獲取肺巨噬細(xì)胞，小鼠可用腹腔灌洗獲得腹腔巨噬細(xì)胞，甚至人也可通過肺灌洗得到。關(guān)于后者，有人利用豚鼠肺巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)純化后，研究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的機(jī)理。例如研究鎘的免疫毒性，證明鎘可以抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抑制白細(xì)胞介素2的產(chǎn)生，且在一定條件下使淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增加及鈣調(diào)素(CaM)活性降低，此為鎘的免疫毒性機(jī)理研究提供了線索。 隨著腦細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，還可在溫育體系中存在外源化學(xué)物情況下，用微電極插入腦細(xì)胞，通過電信號的變化，更深入地研究外源化學(xué)物對神經(jīng)細(xì)胞的功能損傷。用新生1～2日齡大鼠心室肌分離心肌細(xì)胞，原代培養(yǎng)4天后，將微電極(直徑)插入細(xì)胞內(nèi)，研究鎘對心肌的影響。 此外，將分離的心肌細(xì)胞于培養(yǎng)的24~48h期間，利用膜片鉗的連細(xì)胞電壓鉗法，描記心肌細(xì)胞上的B型、L型及T型3種Ca2＋通道的單通道活動。進(jìn)一步證實鎘對心肌有毒性效應(yīng)。有的利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立了特殊的試驗方法。例如1926年Hull等人選育傳代培養(yǎng)的LLCPK1細(xì)胞是來源于Hampshire豬。此后又建立了從鼬(opossum)獲得的OK株系、從兔獲得的RCSVI株系。 2. 胚胎細(xì)胞 利用胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)，篩檢和研究外源化學(xué)物的毒性效應(yīng)。此株系在用于篩檢致癌物方面做了一些工作。 此外，人胚主動脈平滑肌細(xì)胞也可作為標(biāo)本傳代培養(yǎng)研究金屬的毒理。 (五) 組織勻漿 取臟器除血污制備組織勻漿，是用物理學(xué)方法使細(xì)胞壁破壞，細(xì)胞組成成分與細(xì)胞間質(zhì)混合形成混懸液。最常使用的是腦勻漿、肝勻漿，雖然肺、腎、腸等臟器也可制備勻漿，但是因纖維結(jié)締組織或肌細(xì)胞不易破碎影響勻漿的質(zhì)量。不少外源化學(xué)物的代謝和以肝臟為靶器官的外源化學(xué)物的毒性效應(yīng)特征與機(jī)理是通過肝勻漿進(jìn)行的。 (六) 亞細(xì)胞組分 將細(xì)胞中各亞細(xì)胞組分分離和純化，對于深入研究外源化學(xué)物的靶位點、探討化學(xué)物毒性效應(yīng)的機(jī)理均十分重要?，F(xiàn)代毒理學(xué)中使用最多的亞細(xì)胞組分是細(xì)胞膜、微粒體及線粒體。血影為常用的細(xì)胞膜標(biāo)本。使用細(xì)胞膜可以進(jìn)行很多的毒理試驗，尤其是在探討化學(xué)物中毒機(jī)理方面。 神經(jīng)末梢斷裂脫落的突觸體(synaptosome)具有類似完整細(xì)胞的功能，除可利用突觸體作為標(biāo)本外，還可進(jìn)一步制備突觸體膜(synaptosome membrane)。 近年來為純化實驗條件，以利于從分子水平研究外源化學(xué)物的毒效應(yīng)機(jī)理，已將人工膜引入毒理學(xué)研究。 2. 微粒體(microsome) 尤其是肝細(xì)胞制備的微粒體常作為毒理學(xué)研究的標(biāo)本，這是由于肝臟代謝酶系主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，即肝細(xì)胞的亞細(xì)胞組分分離后的微粒體中。 3. 線粒體(mitochondria) 它是細(xì)胞中進(jìn)行呼吸作用的主要場所。又據(jù)報道鎘對大鼠肝細(xì)胞線粒體Ca2+ATPase有抑制作用，且使線粒體膜脂流動性下降。 在體外毒理學(xué)中則主要是定量研究外源化學(xué)物對靶酶作用的特征、性質(zhì)和機(jī)理。由于酶的提純技術(shù)復(fù)雜，故而在一般毒理學(xué)研究中多用臟器勻漿和亞細(xì)胞組分作為酶源。 有報道金屬離子Cd2+、Hg2+、Pb2+對一些鈣調(diào)素依賴酶就具有雙向效應(yīng)，即在低濃度時可以激活這些酶，而高濃度時又可抑制酶的活性。經(jīng)酶動力學(xué)分析，有機(jī)磷化合物與AChE底物ACh呈競爭性；即有機(jī)磷化合物對AChE為競爭性的不可逆性抑制物。 第二節(jié) 哺乳動物細(xì)胞制備和培養(yǎng) 一、概述 到目前為止，分離的細(xì)胞是毒理學(xué)中使用最廣泛和最深入的體外實驗系統(tǒng)。在毒理學(xué)中以哺乳動物細(xì)胞作為實驗動物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢的原因有三：一是來自公眾要求減少實驗中使用動物數(shù)量的壓力；二是非整體動物實驗可顯著地減少常規(guī)整體動物實驗所需的高額費用；三是人們越來越不滿意實驗動物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。表122詳細(xì)列出細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)缺點。 多為短期試驗，對亞慢性或慢性毒性的評估價值不大表123 毒理學(xué)研究中常用細(xì)胞各種物種的成纖維細(xì)胞淋巴母細(xì)胞腹水瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞肝 細(xì) 胞肝癌細(xì)胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細(xì)胞肺的各種類型細(xì)胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的睪丸細(xì)胞膀胱細(xì)胞心臟細(xì)胞脊髓微血管細(xì)胞脂肪細(xì)胞 由于哺乳細(xì)胞作為體外實驗系統(tǒng)的優(yōu)越性，在毒理學(xué)中，已有許多不同類型細(xì)胞應(yīng)用于毒理學(xué)實驗。利用哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行毒理學(xué)體外實驗有兩種方法：一是建立正在迅速生長的細(xì)胞株，用以觀察受試物對整體細(xì)胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用；二是