【正文】 利用已高度分化的細胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細胞株，研究受試物對已分化成熟的細胞或其功能的特殊毒作用； 二、基本技術（一） 儀器與設備 1. 培養(yǎng)箱 一般來說，在5％CO2，95％空氣和99％的相對濕度的條件下，許多細胞可存活。其基本要求：①精確地溫度控制調節(jié)，℃，箱內溫度的均衡可依賴風扇；②CO2濃度調節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測箱內CO2濃度；使箱內大氣為5％CO2，95％空氣；③箱內濕度，可用水盤來維持。例如，原代肝細胞培養(yǎng)，可用LeibovitzL5介質，不需CO2，而要求敞開培養(yǎng)瓶，以供給較高的O2分壓。 3. 顯微鏡 最基本的配置是一臺簡單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細胞，以便依據(jù)細胞生長狀況，進行調整或對污染進行補救或處理。 4. 超凈工作臺 在沒有無菌操作室的條件下；可用超凈工作臺。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點，但它尚難絕對除去病毒類微生物，而且灰塵過多對凈化作用不利，故超凈工作臺最好安置在清潔無塵的房間。 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、無毒性、有利于細胞生長的優(yōu)點。 玻璃器皿在實驗室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml； ③離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細胞洗滌。液氮貯存器有25L和50L兩種規(guī)格，它與液氮運輸瓶，或稱杜瓦瓶不同，因液氮貯存器一般每兩周需補充一次液氮。 8. 水純化裝置 細胞培養(yǎng)對水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。但是，在細胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機物。外購蒸餾水或去離子，應在本實驗室重蒸后使用。同一實驗盡量使用同一水源，避免水質量造成結果的差異。濾過消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。 天平，包括普通臺秤、扭力天平和分析天平，用于配制各種培養(yǎng)液、酶消化液及生理鹽水等。 電磁攪拌器，微量加樣器等。培養(yǎng)液的選擇取決于細胞生長的要求，故它是維持細胞生存和生長所需的基本溶液，它的主要成分為平衡鹽溶液和適應細胞體外培養(yǎng)的各種溶液。應特別注意下列問題：①容器，應仔細認真清洗，必要時須消毒；②水，三次重蒸蒸餾水；③嚴格選擇品質優(yōu)良的藥品；④制備好的培養(yǎng)介質要標明名稱、配制日期及配制者；⑤貯存與消毒。它具有維持滲透壓、控制酸堿度平衡的作用及供給細胞生存所需的能量和無機鹽的成分。 2. 小牛血清 是細胞培養(yǎng)中最常見的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營養(yǎng)物質，對細胞附著和保護也有明顯的作用。彌補個體差異的辦法是對血清進行無菌檢測和支持生長能力測定后，混合使用。 3. 合成培養(yǎng)基 系依據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質模擬合成的。根據(jù)需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脫氧核糖及丙酮酸鈉等)、核酸的前體物(嘌呤和嘧啶類化合物)及氧化還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽等。有時，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。常用抗生素有青霉素、鏈霉素及慶大霉素等。常用的消化液有胰蛋白溶液(％％)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶液(％)。％、％%。使用終濃度為10～15mmol／L。 固定液：常用的有①中性緩沖福爾馬林，相當于10％的福爾馬林；②Bouin氏固定液；③醋酸甲醇，臨用前配制，結合Giemsa染色效果較好；④FAA固定液，由福爾馬林、冰醋酸及80％酒精組成，用于蓋片單層培養(yǎng)的固定。消毒措施應在細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)嚴格執(zhí)行。 對不同的細胞培養(yǎng)所用物品，可采用不同的消毒滅菌的方法。主要消毒方面法介紹如下： 1. 紫外線 適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好。 2. 高壓蒸氣消毒 它適于金屬器械、膠塞、布類及某些培養(yǎng)液。或者更簡單的，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。加溫應到160℃，保持90120min。過濾除菌效果較佳。 三、培養(yǎng)細胞的鑒定 對培養(yǎng)細胞的鑒定有兩個目的：一是觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細胞；二是培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對培養(yǎng)細胞的影響。對于培養(yǎng)細胞的鑒定包括污染鑒定、生存指標及細胞性質(如細胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結構等)。受到污染的細胞培養(yǎng)可明顯地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩。肉眼見不到的污染可影響細胞的代謝。由于用肉眼無法發(fā)現(xiàn)支原體的污染，在細胞培養(yǎng)過程中應經(jīng)常定期檢查，例如每三個月。 2. 處理 基本的良好消毒技術并不一定能防止污染，還應注意下列方面：消毒步驟(如高壓鍋和干熱消毒柜)的效果；多層流防護罩的消毒效果；經(jīng)常檢查培養(yǎng)器皿；每個工作者有自己配制的培養(yǎng)用液，處理受污染的培養(yǎng)用具和環(huán)境。用抗生素對預防或去除細菌污染較為有效。 (二) 生存指標 1. 臺盼藍排斥試驗 是判定細胞損傷的快速試驗，它還可很方便進行細胞計數(shù)。 ②放置15min后，將混合液滴入血細胞計數(shù)池內。統(tǒng)計出細胞總數(shù)后，可計算出細胞存活率。 (1) 儀器：分光光度計，最好配有溫育(37℃)的裝置。 底物 K2HPO4。 NADH，稱42mg，％NaHCO3，臨用前配制。例如肝細胞用50g2min。保持在0℃以下，備用。整個過程應在37℃條件下完成。 3. 其它方法 鉻的釋放，利用51Cr3+可被活細胞吸收，并還原成51Cr3+，留在胞內，而死亡細胞則釋放51Cr3+。還有貼壁效率和ATP含量等指標可鑒定培養(yǎng)細胞的存活情況。但每一細胞株具有一系列細胞特性“正?！钡膮?shù)，可供鑒定評價。 1. 形態(tài)學檢查 評價細胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學檢查；應在每次傳代時用倒置顯微鏡進行觀察，最好拍照記錄細胞的形態(tài)。若因限于篇幅，不能詳述，可掌握兩個述語，即“成纖維樣”和“上皮樣”細胞，即可描述所觀察的細胞。 2. 生長特性的檢查 在培養(yǎng)細胞時，其生長特性的檢查較易進行，主要通過測定更換培養(yǎng)液的時間和傳代的時間來完成。 每個細胞系均有其自己的生長循環(huán)周期，這取決于接種進行培養(yǎng)的細胞數(shù)目。進行生長分析，應觀察單個細胞的生長速率?？寺⌒适菧y定由單個細胞生長的克隆。接種效率= 一般認為，傳代效率小于30表示生長不正常。 在細胞培養(yǎng)試驗中，一般監(jiān)測指標可采用形態(tài)學、生長模式及接種效率即可。 七、細胞培養(yǎng)在食品毒理學中應用 利用培養(yǎng)的細胞，可進行多方面的毒理學研究，如表124中所列。 1. 細胞類型的選擇 細胞類型的選擇取決于實驗的目的。機理研究多不用細胞系，因為培養(yǎng)的細胞會逐漸喪失許多功能，如細胞色素P450的活性。成纖維樣細胞和上皮樣細胞均可選用。 2. 代謝活化 細胞經(jīng)824h培養(yǎng)后，細胞色素P450活性將迅速下降。所以，培養(yǎng)細胞對需代謝活化的化學物不能夠敏感。S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖6磷酸脫氫酶、葡萄糖6磷酸和NADP)。 3. 受試物的給予許多 受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機溶劑有機溶劑對細胞有損害作用，故應限制有機溶劑濃度在1％以下。例如，需用S9混合液；％，因為許多有機溶劑可抑制酶的活性。一般是混懸于培養(yǎng)液或者先溶于溶劑，再加人培養(yǎng)液，但有時會產(chǎn)生不同的毒性結果。 4. 設立陽性對照組 實驗系統(tǒng)的重現(xiàn)性應該用陽性對照物來檢查。例如在代謝活化研究中常選擇環(huán)磷酰胺為陽性對照物，在細胞毒性篩檢時可選二甲基環(huán)己基烴乙基戊二酰亞胺和二硝基苯酚為陽性對照物。下列指標在毒理學中經(jīng)常采用： (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對照組一半時所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細胞毒性的常規(guī)篩檢。 (2) 細胞膜損傷：可選擇臺盼藍攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標來評價細胞膜的損傷。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標外，還有毒物代謝酶的活性、細胞膜脂質過氧化作用及[14C]葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細胞的代謝能力。 第三節(jié) 亞細胞組分制備及其檢測方法 細胞由許多亞細胞組分組成，如核、線粒體、內質網(wǎng)膜、溶酶體及高爾基氏體等，它們在維持細胞正常生理功能方面起著重要的作用。在毒理學中，亞細胞組分作為遺傳毒性測定中的代謝活化系統(tǒng)，如S9已普遍運用。但它離開子整體細胞，也有其局限性；即它僅提供有關一些特殊作用能力的特定信息?，F(xiàn)就微粒體和線粒體的制備及其檢測方法加以介紹。它是利用兩者的間隙將細胞破碎，~。它較適合肝細胞、腎細胞及腦細胞的破碎，而對肺、甲狀腺等結締組織較多的組織效果不佳。使用本法破碎細胞應注意：①在低溫下操作避免勻漿磨擦生熱和室溫影響實驗結果；②馬達速度不宜過快，慢速可獲更大的扭力矩；③勻漿上下次數(shù)，即杵由玻璃套管上部下到底部，再回到上部，一般肝細胞勻漿上下8~10次即可達到破碎目的。離心機應配備各種類型的轉頭，以供亞細胞組分制備時差速離心選用。 (二) 勻漿介質和緩沖液 最常用的勻漿介質為等滲的蔗糖(／L)和氯化鉀(／L)。勻漿緩沖液可含有5~50mmol／L的Tris或Hepes。HCI緩沖液。 (三) 生物樣品 實驗動物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應迅速處死，常用的方法是斷頭處死。對于大實驗動物，如狗等，應在適當?shù)穆樽項l件下，放血處死。為了減少實驗誤差，應參考動物的年齡、性別、品系、健康狀況、飲食類型和飼養(yǎng)環(huán)境等因素。為避免肝糖原影響，大鼠應禁食過夜。其方法是以小鼠80mg／(kgd)，經(jīng)腹腔注射或與生理鹽水混合灌胃，連續(xù)3~5天即可誘導細胞色素P450的活力。主要誘導細胞色素P450。β萘黃酮的使用方法是小鼠40mg／(kgd)，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)3～4天，即可達到誘導作用。 3. 多氯聯(lián)苯 常用多氯聯(lián)苯誘導物是Arochlorl254，它是混合型的誘導物，即同時誘導細胞色素P450和細胞色素P448，劑量依多氯聯(lián)苯種類不同而異，需做預試驗來確定。由于微粒體含有混合功能氧化酶，其在毒理學研究中有著重要地位，故微粒體是毒理學中較常用的體外系統(tǒng)。 2. 將肝轉入小燒杯，用剪刀剪碎肝臟，加入適當勻漿介質，一般為3ml／g肝臟。 3. 按示意圖操作離心。在第二次超速離心后，如為了減少血紅蛋白的影響，可加勻漿介質將沉淀重新懸浮，將所制備的微粒體再洗滌一次。HCl緩沖液，／L KCl，l mmol／LEDTA和20％甘油，貯存于20～70℃或是液氮中。 4. 其它方法 除超速離心法制備微粒體外，還有凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點沉淀法也可以制得微粒體。鈣沉淀法適于沒有超速離心機的實驗室使用。不足之處是鈣離子可影響某些酶的活性以及造成核糖體的丟失。其優(yōu)點也是不需超速離心機，不足之處是酸性條件下，可使某些酶和CytP450失活。對于較軟的臟器，如腎臟、睪丸和腦與肝微粒體制備的操作變動不大。因為，小腸僅上皮細胞含有外源化學物的代謝酶，在小腸的不同區(qū)域其酶活性也不一樣，以及腸內的蛋白酶可迅速降解代謝酶。 肝外組織的細胞色素P450的含量和有關酶活性遠較肝組織低。 三、混合功能氧化酶系的測定方法 MFO催化的反應類型繁多，且底物特異性不強，故有多種方法用于MFO測定，可分為直接法和代謝法。代謝法是通過測定MFO催化反應中的底物消耗量或產(chǎn)物生成量，間接了解MFO活力。(一) 直接法 1. 細胞色素P450含量測定 細胞色素P450是MFO的主要成分，起到終末氧化酶的作用。利用其在450nm的最大吸收光譜，可測得樣品中CytP450的含量。因為微粒體樣品是濁狀樣品，需雙光束分光光度計，在450nm和490nm處進行差示光譜分析。 (4) 計算： CytP450含量(nmol／mgPr)=式中：ΔA為450nm處光密度值與490nm光密應值之差 91為CytP450的消光系數(shù)，單位：cm2／mmol r為比色杯光徑長度，單位：cm C為微粒體制備物的蛋白濃度，單位：mg／ml (5) 注意事項：一氧化碳吹泡保持氣泡單個放出為宜，太快會將樣品吹走。本法對肝微粒體制備物較為適合，而對肝外組織，因影響因素如血紅蛋白及本身含量不高，不宜用本法測定。在實驗工作中，它的活力較難測定，且需要特殊儀器。其原理是氧化型細胞色素C被轉變成還原型細胞色素C時，在550nm處有典型的最大吸收峰。它能評定CytP450總含量，但不能確定某一CytP450亞型的改變，也就是說不能測定MFO催化某一特定反應活動的影響。 1. NADPH消耗量測定 NADPH參與MFO的催化作用過程，故通過測定NADPH的氧化，即NADPH消耗量，可間接了解MFO活力。／L Tris ～／L。 而且它不可能區(qū)分細胞色素P450各種同工酶的作用，所以用該法來評價MFO活力，在準確性和專一性等方面均有不足。本法測定簡便易行，不失為MFO重組體系中較好的測定方法。本法也有與NADPH消耗量測定類似的缺點，即微粒體制備物中有較多的酶系在催化過程中均有氧的消耗。此外，也可能有脂質過氧化作用發(fā)生，所以，氧耗測定法對評價微粒體制備物MFO活力的應用受到一定的限制。mg1蛋白。故評定MFO活力時，多改用其代謝產(chǎn)物生成量的測定。依據(jù)測定技術，代謝產(chǎn)物測定方法又可分為可見紫外分光光度法、熒光分光光度法、氚標記放射