【文章內(nèi)容簡介】 盼藍(lán)排斥試驗 是判定細(xì)胞損傷的快速試驗，它還可很方便進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。具體方法如下： ①取少量細(xì)胞混懸液，％臺盼藍(lán)溶液。 ②放置15min后，將混合液滴入血細(xì)胞計數(shù)池內(nèi)。 ③顯微鏡下，細(xì)胞顯藍(lán)色的為死亡細(xì)胞，尤其是核深染，而未染的細(xì)胞為存活細(xì)胞。統(tǒng)計出細(xì)胞總數(shù)后，可計算出細(xì)胞存活率。 2. 酶漏出的檢測 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測也與染料排斥試驗有同樣的靈敏度，同時，可更精確地進(jìn)行定量，但操作時間較長。 (1) 儀器：分光光度計，最好配有溫育(37℃)的裝置。 (2) 試劑： 溶液 ％NaCl，％％牛血清白蛋白。 底物 K2HPO4。配好后，可貯存于20℃的冰箱內(nèi)。 NADH，稱42mg，％NaHCO3，臨用前配制。 (3) 操作步驟：離心，以適當(dāng)速度使所有細(xì)胞沉淀而不引起細(xì)胞損傷。例如肝細(xì)胞用50g2min。取出上清，放人干凈試管，并保持0℃以下備用，加入等量的溶液至細(xì)胞沉淀，用漩渦混合器混合。保持在0℃以下，備用。 取一比色杯，加3ml底物，50μl的NADH和25~200μl的樣品(取決于培養(yǎng)細(xì)胞的種類)，迅速混合后，在340nm處進(jìn)行比色。整個過程應(yīng)在37℃條件下完成。計算上清或沉淀(即溶液中細(xì)胞)的LDH活性，漏出率表示方法為培養(yǎng)液中LDH活性占總的LDH活性的百分率。 3. 其它方法 鉻的釋放，利用51Cr3+可被活細(xì)胞吸收，并還原成51Cr3+，留在胞內(nèi)，而死亡細(xì)胞則釋放51Cr3+。用r計數(shù)器檢測無細(xì)胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。還有貼壁效率和ATP含量等指標(biāo)可鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。 (三) 細(xì)胞特性鑒定 在連續(xù)培養(yǎng)期間，細(xì)胞可能發(fā)生某些變化，如細(xì)胞與原始細(xì)胞的差異逐漸加大。但每一細(xì)胞株具有一系列細(xì)胞特性“正?！钡膮?shù)，可供鑒定評價。例如，形態(tài)學(xué)參數(shù)、生長特性及染色體分析等皆為細(xì)胞特性鑒定的指標(biāo)，其中形態(tài)學(xué)與生長特性的測定相對容易進(jìn)行。 1. 形態(tài)學(xué)檢查 評價細(xì)胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學(xué)檢查；應(yīng)在每次傳代時用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，最好拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)。要詳細(xì)地描述每一細(xì)胞系的形態(tài)。若因限于篇幅，不能詳述，可掌握兩個述語，即“成纖維樣”和“上皮樣”細(xì)胞，即可描述所觀察的細(xì)胞。成纖維樣細(xì)胞系指在單層細(xì)胞培養(yǎng)時，細(xì)胞的長度要大于其寬度的兩倍的細(xì)胞，而上皮樣細(xì)胞系指呈多角形的細(xì)胞。 2. 生長特性的檢查 在培養(yǎng)細(xì)胞時，其生長特性的檢查較易進(jìn)行，主要通過測定更換培養(yǎng)液的時間和傳代的時間來完成。雖然不同的細(xì)胞其傳代時間和更換培養(yǎng)液的時間不同，但對于每一細(xì)胞系應(yīng)該較為固定，因為主要取決于細(xì)胞生長速率。 每個細(xì)胞系均有其自己的生長循環(huán)周期，這取決于接種進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目。一般認(rèn)為，在培養(yǎng)中的細(xì)胞，是處于不同的生長階段。進(jìn)行生長分析，應(yīng)觀察單個細(xì)胞的生長速率。在實際工作中，是測定克隆效率或者接種效率?？寺⌒适菧y定由單個細(xì)胞生長的克隆。接種效率是測定植入小量細(xì)胞(2~50個／cm2)后，等生長至可分辨的小克隆時，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水沖洗后，計算克隆數(shù)。接種效率= 一般認(rèn)為，傳代效率小于30表示生長不正常。此項指標(biāo)可用于正常細(xì)胞生長的監(jiān)測，貯存細(xì)胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。 在細(xì)胞培養(yǎng)試驗中，一般監(jiān)測指標(biāo)可采用形態(tài)學(xué)、生長模式及接種效率即可。 3. 其它檢查 除上述指標(biāo)外，在細(xì)胞培養(yǎng)時，可進(jìn)行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細(xì)胞的特性。 七、細(xì)胞培養(yǎng)在食品毒理學(xué)中應(yīng)用 利用培養(yǎng)的細(xì)胞，可進(jìn)行多方面的毒理學(xué)研究，如表124中所列。表124 培養(yǎng)細(xì)胞用于毒理學(xué)體外實驗的實例 一般毒性：主要為急性細(xì)胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細(xì)胞類型如肝細(xì)胞、腎近曲小管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞等： 毒作用機(jī)理 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測定 繁殖毒性 聯(lián)合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏毒性 以下重點討論毒理學(xué)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時應(yīng)注意的幾個問題。 1. 細(xì)胞類型的選擇 細(xì)胞類型的選擇取決于實驗的目的。一般性篩選系列化合物的一般毒性時，應(yīng)選擇生長迅速且易于處理的細(xì)胞系。機(jī)理研究多不用細(xì)胞系，因為培養(yǎng)的細(xì)胞會逐漸喪失許多功能，如細(xì)胞色素P450的活性。 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點之一是可選擇來源于人體的組織細(xì)胞，可減少試驗結(jié)果的物種差異。成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞均可選用。常用的細(xì)胞系有CHO、V7Hela、BHR及L929等。 2. 代謝活化 細(xì)胞經(jīng)824h培養(yǎng)后，細(xì)胞色素P450活性將迅速下降。而在CHO細(xì)胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細(xì)胞對需代謝活化的化學(xué)物不能夠敏感。 解決這個問題有兩個方法，一是加S9，二是與原代肝細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)。S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應(yīng)加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖6磷酸脫氫酶、葡萄糖6磷酸和NADP)。與原代肝細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)時也可采用其它不同的細(xì)胞系，如V7中國地鼠肺成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。 3. 受試物的給予許多 受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑對細(xì)胞有損害作用，故應(yīng)限制有機(jī)溶劑濃度在1％以下。在試驗中可設(shè)立適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑對照和培養(yǎng)液對照。例如，需用S9混合液；％，因為許多有機(jī)溶劑可抑制酶的活性。不溶性的受試物如，顆粒和油劑在給予培養(yǎng)液時仍存在問題。一般是混懸于培養(yǎng)液或者先溶于溶劑，再加人培養(yǎng)液，但有時會產(chǎn)生不同的毒性結(jié)果。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時將有某些塑料培養(yǎng)皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 設(shè)立陽性對照組 實驗系統(tǒng)的重現(xiàn)性應(yīng)該用陽性對照物來檢查。陽性對照物指采用經(jīng)過研究或公認(rèn)有特定作用的化學(xué)物。例如在代謝活化研究中常選擇環(huán)磷酰胺為陽性對照物，在細(xì)胞毒性篩檢時可選二甲基環(huán)己基烴乙基戊二酰亞胺和二硝基苯酚為陽性對照物。 5. 毒性指標(biāo)的選擇 依據(jù)不同的試驗?zāi)康暮驮囼灄l件，可選擇不同的觀察指標(biāo)。下列指標(biāo)在毒理學(xué)中經(jīng)常采用： (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對照組一半時所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細(xì)胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評價細(xì)胞特性的指標(biāo)，如形態(tài)學(xué)和接種效率等，均可采用。 (2) 細(xì)胞膜損傷：可選擇臺盼藍(lán)攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標(biāo)來評價細(xì)胞膜的損傷。 (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗和[3H]尿嘧啶參入RNA試驗等指標(biāo)，以判斷受試物對培養(yǎng)細(xì)胞的大分子合成與降解的有無作用。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標(biāo)外，還有毒物代謝酶的活性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用及[14C]葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細(xì)胞的代謝能力。 (5) 形態(tài)學(xué)觀察：通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。 第三節(jié) 亞細(xì)胞組分制備及其檢測方法 細(xì)胞由許多亞細(xì)胞組分組成，如核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體及高爾基氏體等，它們在維持細(xì)胞正常生理功能方面起著重要的作用。故許多外源化學(xué)物引起機(jī)體的損害作用，有可能與亞細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)與功能損傷有關(guān)。在毒理學(xué)中，亞細(xì)胞組分作為遺傳毒性測定中的代謝活化系統(tǒng)，如S9已普遍運用。此外，亞細(xì)胞組分主要用于中毒機(jī)理的分子水平研究，因它們是從整體細(xì)胞上在自然環(huán)境下分離出來的，使毒理學(xué)家在體外條件下，有可能更深入了解外源化學(xué)物在毒作用部位的作用機(jī)理。但它離開子整體細(xì)胞，也有其局限性；即它僅提供有關(guān)一些特殊作用能力的特定信息。對外源化學(xué)物毒作用機(jī)理研究，還應(yīng)結(jié)合其它研究如整體試驗、細(xì)胞試驗等，綜合作出評價?，F(xiàn)就微粒體和線粒體的制備及其檢測方法加以介紹。 一、基本技術(shù) (一) 設(shè)備 1. 勻漿器(homogenizer) 常用勻漿器為Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管組成。它是利用兩者的間隙將細(xì)胞破碎，~。杵是由馬達(dá)傳動，其速度在2000rpm以內(nèi)，且可調(diào)節(jié)。它較適合肝細(xì)胞、腎細(xì)胞及腦細(xì)胞的破碎，而對肺、甲狀腺等結(jié)締組織較多的組織效果不佳。勻漿器可從5ml至50ml大小不等，依實驗需要加以選擇。使用本法破碎細(xì)胞應(yīng)注意：①在低溫下操作避免勻漿磨擦生熱和室溫影響實驗結(jié)果；②馬達(dá)速度不宜過快，慢速可獲更大的扭力矩；③勻漿上下次數(shù)，即杵由玻璃套管上部下到底部，再回到上部，一般肝細(xì)胞勻漿上下8~10次即可達(dá)到破碎目的。 2. 離心機(jī) 是亞細(xì)胞組分制備的關(guān)鍵設(shè)備，一般需要低溫高速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為18 000～24000rpm，和超速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。離心機(jī)應(yīng)配備各種類型的轉(zhuǎn)頭，以供亞細(xì)胞組分制備時差速離心選用。離心管最好為聚丙烯的，因其透明性較好。 (二) 勻漿介質(zhì)和緩沖液 最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(／L)和氯化鉀(／L)。蔗糖為經(jīng)典亞細(xì)胞組分分離研究所選用，而氯化鉀更適合外源化學(xué)物代謝酶的研究，如它可更有效除去微粒體制備物中的血紅蛋白，減少光譜測定的干擾。勻漿緩沖液可含有5~50mmol／L的Tris或Hepes。 ／L KCl的50mmol／L TrisHCI緩沖液。此緩沖液在4℃條件下，至少貯存12周不變質(zhì)。 (三) 生物樣品 實驗動物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應(yīng)迅速處死，常用的方法是斷頭處死。應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。對于大實驗動物，如狗等，應(yīng)在適當(dāng)?shù)穆樽項l件下，放血處死。盡快取出所需臟器，如肝、腎、肺及腦等，置人冰的勻漿介質(zhì)中。為了減少實驗誤差，應(yīng)參考動物的年齡、性別、品系、健康狀況、飲食類型和飼養(yǎng)環(huán)境等因素。此外，為避免晝夜節(jié)律影響，每次實驗應(yīng)在相同時間處死動物。為避免肝糖原影響，大鼠應(yīng)禁食過夜。 (四) 微粒體酶的誘導(dǎo)方法 1. 苯巴比妥鈉 它是常用的誘導(dǎo)劑之一。其方法是以小鼠80mg／(kgd)，大鼠100mg／(kgd)，經(jīng)腹腔注射或與生理鹽水混合灌胃，連續(xù)3~5天即可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450的活力。還可以將藥溶于飲水，1ng／ml，大約7天后，可達(dá)到誘導(dǎo)效果。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450。 2. p萘黃酮(βnaphthoflavone) 它是多環(huán)芳烴類的誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448，同類誘導(dǎo)物還有3甲基膽葸(3methylcholanthrene)。β萘黃酮的使用方法是小鼠40mg／(kgd)，大鼠80mg／(kgd)，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)3～4天，即可達(dá)到誘導(dǎo)作用。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448。 3. 多氯聯(lián)苯 常用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)物是Arochlorl254，它是混合型的誘導(dǎo)物，即同時誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450和細(xì)胞色素P448，劑量依多氯聯(lián)苯種類不同而異，需做預(yù)試驗來確定。 二、微粒體的制備 微粒體(microsome)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨立的細(xì)胞器。由于微粒體含有混合功能氧化酶，其在毒理學(xué)研究中有著重要地位，故微粒體是毒理學(xué)中較常用的體外系統(tǒng)。 (一) 肝微粒體制備 1. 以斷頭方法處死動物，迅速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水或勻漿介質(zhì)洗凈血污，剪去粘連的組織，用濾紙輕輕吸干表面水分，稱重。 2. 將肝轉(zhuǎn)入小燒杯，用剪刀剪碎肝臟，加入適當(dāng)勻漿介質(zhì)，一般為3ml／g肝臟。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。 3. 按示意圖操作離心。 肝勻槳離心，10000g 20 min 上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去在第一次離心去除線粒體、核等物質(zhì)時，離心管上層漂浮有脂質(zhì)層，應(yīng)用吸管將其除去，再收集上清液。在第二次超速離心后，如為了減少血紅蛋白的影響，可加勻漿介質(zhì)將沉淀重新懸浮，將所制備的微粒體再洗滌一次。沉淀即微粒體，懸浮于10mmol／L HepesHCl緩沖液，／L KCl，l mmol／LEDTA和20％甘油，貯存于20～70℃或是液氮中。應(yīng)強調(diào)的是貯存方式和時間對微粒體酶的活性或特征會有不同程度的影響。 4. 其它方法 除超速離心法制備微粒體外，還有凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點沉淀法也可以制得微粒體。凝膠過濾法不適于做多個樣品。鈣沉淀法適于沒有超速離心機(jī)的實驗室使用。其方法是在去線粒體的上清液中加入鈣離子，使其終濃度為8mmol／L CaCl2，此時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分產(chǎn)生鈣依賴性聚集，在較低的離心條件，2000~25 000g，20min即可將其沉淀。不足之處是鈣離子可影響某些酶的活性以及造成核糖體的丟失。等電點沉淀法是利用pH改變，使微粒體沉淀出來，在較低離心條件下，10000g l0min，即可制得微粒體。其優(yōu)點也是不需超速離心機(jī)，不足之處是酸性條件下，可使某些酶和CytP450失活。 (二) 肝外組織微粒體的制備 肝微粒體制備過程中的一般性規(guī)則對于肝外組織同樣適用。對于較軟的臟器，如腎臟、睪丸和腦與肝微粒體制備的操作變動不大。對于結(jié)締組織較多的肺、皮膚等臟器和對于小腸微粒體的制備較為麻煩。因為，小腸僅上皮細(xì)胞含有外源化學(xué)物的代謝酶，在小腸的不同區(qū)域