【正文】 源化學(xué)物代謝酶的研究，如它可更有效除去微粒體制備物中的血紅蛋白，減少光譜測定的干擾。離心管最好為聚丙烯的，因其透明性較好。 2. 離心機 是亞細胞組分制備的關(guān)鍵設(shè)備，一般需要低溫高速離心機，最大轉(zhuǎn)速為18 000～24000rpm，和超速離心機，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。勻漿器可從5ml至50ml大小不等，依實驗需要加以選擇。杵是由馬達傳動，其速度在2000rpm以內(nèi)，且可調(diào)節(jié)。 一、基本技術(shù) (一) 設(shè)備 1. 勻漿器(homogenizer) 常用勻漿器為Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管組成。對外源化學(xué)物毒作用機理研究，還應(yīng)結(jié)合其它研究如整體試驗、細胞試驗等，綜合作出評價。此外，亞細胞組分主要用于中毒機理的分子水平研究，因它們是從整體細胞上在自然環(huán)境下分離出來的，使毒理學(xué)家在體外條件下，有可能更深入了解外源化學(xué)物在毒作用部位的作用機理。故許多外源化學(xué)物引起機體的損害作用，有可能與亞細胞組分的結(jié)構(gòu)與功能損傷有關(guān)。 (5) 形態(tài)學(xué)觀察：通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對培養(yǎng)細胞的形態(tài)改變情況。 (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗和[3H]尿嘧啶參入RNA試驗等指標(biāo)，以判斷受試物對培養(yǎng)細胞的大分子合成與降解的有無作用。此外，前述評價細胞特性的指標(biāo)，如形態(tài)學(xué)和接種效率等，均可采用。 5. 毒性指標(biāo)的選擇 依據(jù)不同的試驗?zāi)康暮驮囼灄l件，可選擇不同的觀察指標(biāo)。陽性對照物指采用經(jīng)過研究或公認有特定作用的化學(xué)物。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時將有某些塑料培養(yǎng)皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。不溶性的受試物如，顆粒和油劑在給予培養(yǎng)液時仍存在問題。在試驗中可設(shè)立適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑對照和培養(yǎng)液對照。與原代肝細胞進行復(fù)合培養(yǎng)時也可采用其它不同的細胞系，如V7中國地鼠肺成纖維細胞和人成纖維細胞。 解決這個問題有兩個方法，一是加S9，二是與原代肝細胞復(fù)合培養(yǎng)。而在CHO細胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。常用的細胞系有CHO、V7Hela、BHR及L929等。 細胞培養(yǎng)的優(yōu)點之一是可選擇來源于人體的組織細胞，可減少試驗結(jié)果的物種差異。一般性篩選系列化合物的一般毒性時，應(yīng)選擇生長迅速且易于處理的細胞系。表124 培養(yǎng)細胞用于毒理學(xué)體外實驗的實例 一般毒性：主要為急性細胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細胞類型如肝細胞、腎近曲小管細胞、神經(jīng)細胞及心肌細胞等： 毒作用機理 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測定 繁殖毒性 聯(lián)合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏毒性 以下重點討論毒理學(xué)中應(yīng)用細胞培養(yǎng)技術(shù)時應(yīng)注意的幾個問題。 3. 其它檢查 除上述指標(biāo)外，在細胞培養(yǎng)時，可進行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細胞的特性。此項指標(biāo)可用于正常細胞生長的監(jiān)測，貯存細胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。接種效率是測定植入小量細胞(2~50個／cm2)后，等生長至可分辨的小克隆時，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水沖洗后，計算克隆數(shù)。在實際工作中，是測定克隆效率或者接種效率。一般認為，在培養(yǎng)中的細胞，是處于不同的生長階段。雖然不同的細胞其傳代時間和更換培養(yǎng)液的時間不同，但對于每一細胞系應(yīng)該較為固定，因為主要取決于細胞生長速率。成纖維樣細胞系指在單層細胞培養(yǎng)時，細胞的長度要大于其寬度的兩倍的細胞，而上皮樣細胞系指呈多角形的細胞。要詳細地描述每一細胞系的形態(tài)。例如，形態(tài)學(xué)參數(shù)、生長特性及染色體分析等皆為細胞特性鑒定的指標(biāo)，其中形態(tài)學(xué)與生長特性的測定相對容易進行。 (三) 細胞特性鑒定 在連續(xù)培養(yǎng)期間，細胞可能發(fā)生某些變化，如細胞與原始細胞的差異逐漸加大。用r計數(shù)器檢測無細胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養(yǎng)細胞的存活情況。計算上清或沉淀(即溶液中細胞)的LDH活性，漏出率表示方法為培養(yǎng)液中LDH活性占總的LDH活性的百分率。 取一比色杯，加3ml底物，50μl的NADH和25~200μl的樣品(取決于培養(yǎng)細胞的種類)，迅速混合后，在340nm處進行比色。取出上清，放人干凈試管，并保持0℃以下備用，加入等量的溶液至細胞沉淀，用漩渦混合器混合。 (3) 操作步驟：離心，以適當(dāng)速度使所有細胞沉淀而不引起細胞損傷。配好后，可貯存于20℃的冰箱內(nèi)。 (2) 試劑： 溶液 ％NaCl，％％牛血清白蛋白。 2. 酶漏出的檢測 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測也與染料排斥試驗有同樣的靈敏度，同時，可更精確地進行定量，但操作時間較長。 ③顯微鏡下，細胞顯藍色的為死亡細胞，尤其是核深染，而未染的細胞為存活細胞。具體方法如下： ①取少量細胞混懸液，％臺盼藍溶液。對支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動物體內(nèi)接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿意，最好的辦法是棄去，再重新培養(yǎng)。％高氯酸處理。最簡便和最可靠的檢測支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。 1. 鑒定方法 真菌或細菌的污染可用肉眼或低倍光學(xué)顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst 33258染色后在光學(xué)顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。污染常常表現(xiàn)為pH變化，培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細胞生長表面的斑點，搖動培養(yǎng)器皿可消失。 (一) 污染鑒定 細胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細胞的污染。因為培養(yǎng)條件的一致性，對于實驗結(jié)果的可信性有極為重要的影響。 5. 消毒劑 適于操作者的皮膚、操作表面和臺面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸及70％酒精。 4. 濾過消毒 適于大多數(shù)培養(yǎng)用液。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。一般要求15磅壓力下20min。應(yīng)注意其可產(chǎn)生臭氧，影響健康。一般有兩類：一是物理滅菌法，即利用紫外線、干熱及微孔過濾等；二是化學(xué)滅菌法，即利用化學(xué)消毒劑。細胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細菌、真菌及病毒，它們主要來源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時間過久等。 (三) 消毒技術(shù) 在細胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項工作，它直接影響實驗的結(jié)果。 染色液：常用的有①；②Giemsa染色液。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間保持恒定的pH值范圍。 5. 其它 pH調(diào)整液，為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時，均在臨用前加入NaHCO3溶液。 4. 消化液 進行傳代細胞培養(yǎng)時，為了使細胞脫離生長表面和細胞離散成單個細胞，通常使用消化液。 為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。 如進行無血清培養(yǎng)，除上述營養(yǎng)成分外，還應(yīng)加入纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸和膠原等成分以促進細胞貼壁。如最簡單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。但它有成分較為復(fù)雜、個體差異較大、來源也有一定的限制等不足。它是配制各種培養(yǎng)介質(zhì)的基礎(chǔ)溶液，也是洗滌細胞的溶液。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。 培養(yǎng)液在制備過程中應(yīng)嚴(yán)格操作，避免混入雜質(zhì)。 (二) 培養(yǎng)用液 指細胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調(diào)整液、染液及細胞洗滌液等。 酸度計，用于準(zhǔn)確調(diào)整各種介質(zhì)及生理鹽水的pH。10. 一般設(shè)備 離心機，用于對細胞懸液離心處理，以達到細胞洗滌、調(diào)節(jié)細胞濃度等。 9. 濾過消毒裝置 培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒。對水質(zhì)量應(yīng)經(jīng)常檢測，如pH和電導(dǎo)系數(shù)。 實驗室應(yīng)配備自動加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優(yōu)點。對玻璃器皿也應(yīng)用純水清洗。如有需要可配置貯存器和運輸瓶。 7. 液氮貯存器 貯存細胞多用液氮，液氮溫度在196℃，具有經(jīng)濟、省力和能較好保持細胞生物學(xué)特性的優(yōu)點。主要的塑料瓶皿有；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細胞或單個細胞克隆的生長；②培養(yǎng)皿，規(guī)格有直徑30mm、60mm及l(fā)00mm，與玻璃培養(yǎng)皿相同，尤其有利于集落形成和細胞轉(zhuǎn)化等試驗；③培養(yǎng)瓶，帶有螺旋蓋塞，規(guī)格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養(yǎng)箱中使用；④其它：凍存細胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規(guī)格有200~1000μ1和1μl~100μl二種。 6. 培養(yǎng)器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。 5. 清洗和消毒設(shè)置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160℃以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650500500mm。它是一無菌操作裝置，主要是利用鼓風(fēng)機，驅(qū)動空氣通過高效濾膜凈化后，緩緩?fù)ㄟ^工作臺面，使工作部位構(gòu)成無菌環(huán)境。進行進一步的研究，則需要更高級的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(—20℃)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養(yǎng)介質(zhì)如谷氨酸和血清。有的細胞培養(yǎng)可以不控制CO2分壓。故細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是CO2培養(yǎng)箱。表123為毒理學(xué)實驗中常用的細胞類型，其中有些細胞可來源于人體組織。 表122 體外系統(tǒng)——細胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)、缺點 優(yōu)點 改善效率，減少費用 使用實驗動物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學(xué)物濃度及接觸時間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響 可從同一實驗體系重復(fù)取樣 缺點 缺少整個器官的形態(tài)學(xué)觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。利用細胞，可更嚴(yán)格控制實驗條件，有效地研究毒性作用的生化機理。體外系統(tǒng)分離的細胞包括懸浮液中的新鮮游離細胞、原代培養(yǎng)細胞、細胞株、細胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細胞。但是不同結(jié)構(gòu)的有機磷化合物對AChE的親合力可有很大差別。 文獻中早已證明有機磷化合物的主要靶酶是AChE。雖然這些酶源標(biāo)本含有多酶成分，但是只要測定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結(jié)果。此類研究的基礎(chǔ)工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對純化酶作用的體征、性質(zhì)和機理進行研究，如細胞色素P450重組系統(tǒng)。 (七) 酶 外源化學(xué)物對機體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。據(jù)報道溴氰菊酯(decamethin)在體外試驗中，對線粒體呼吸功能有明顯抑制作用。 有報道TNT在無氧而加人NADPH環(huán)境下與微粒體溫育，用ESR波譜儀檢測出硝基陰離子自由基(ArNO2￣)；而在有氧環(huán)境中能迅速與分子氧反應(yīng)生成硝基化合物與超氧陰離子(O2 )。所謂人工膜，即是以正常細胞膜的膜脂組分，人工合成后用之在—定介質(zhì)中形成人工膜。實驗表明對硫磷在5109mol／L水平即可抑制突觸體的攝鈣功能，并引起突觸體膜脂流動性下降。 以紅細胞膜為例，／L鉛作用僅5min，紅細胞膜遠紫外色譜就出現(xiàn)改變，表明膜蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化。此外肺巨噬細胞、肺細胞、突觸小體等均可制備膜標(biāo)本(先將細胞勻漿破膜，低溫差速離心、梯度離心制備)。 1. 細胞膜 人與動物紅細胞分離后低滲溶血，高速低溫離心可制得紅細胞膜(或稱血影，ghost)。它較組織勻漿優(yōu)越，排除了勻漿中其它因素的影響?，F(xiàn)雖然不少工作已為其它技術(shù)所取代，但是應(yīng)用勻漿作為過篩與初步研究還是有用的，主要因其制備方法簡單、制備周期很短，且不需復(fù)雜的設(shè)備。 文獻中有機磷化合物對神經(jīng)系統(tǒng)Ache抑制的強度及特征，大量工作是通過以腦勻漿為標(biāo)本，主要是以哺乳動物、嚙齒類和昆蟲的腦完成的。利用勻漿為標(biāo)本主要是研究外源化學(xué)物對細胞酶系統(tǒng)的毒理作用。 近十年來，毒理學(xué)相繼引入嚙齒類動物的著床前全胚胎培養(yǎng)技術(shù)(preimplantatation whole embryo culture)、著床后全胚胎培養(yǎng)技術(shù)(postimplantation whole embryo culture)，以及器官培養(yǎng)如腭板培養(yǎng)、胚胎枝芽體外培養(yǎng)等篩檢致畸化學(xué)物均取得一些成果。如人胚肺二倍體細胞在107～108mol／L苯并(a)芘長達28～38代傳代培養(yǎng)下，電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞核外形不規(guī)則、核膜深陷、出現(xiàn)細橋(tiny bridge)伴分葉核形成、核內(nèi)胞漿包涵體、核仁巨大或多核等細胞癌變特征。例如我國用人胚肺纖維母細胞傳代培養(yǎng)人胚肺二倍體細胞，已建立了以2BS為代表的株系。 近年國內(nèi)利用300次傳代培養(yǎng)的LLC—PKl細胞系對鉛的腎毒進行了研究，包括鉛對細胞的