【正文】 (三) 封閉的紅細(xì)胞膜囊泡 有時為了深入研。調(diào)節(jié)為等滲液，即150mmol／L KCI濃度。其制備的方法有： 1. 血影的低滲液中加入濃鹽溶液，成為等滲溶液，置于37％溫育20min，期間可緩慢地攪拌3次，可得一定比例的再封血影。此外，低滲制備的紅細(xì)胞膜雖然去除了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)，但膜的封閉性差；有許多泄漏的空穴。洗滌去除血紅蛋白，即獲紅細(xì)胞膜。研究紅細(xì)胞膜時有三種模式系統(tǒng)可供選擇：洗滌過的完整紅細(xì)胞膜再封血影(resealed ghost)及封閉的紅細(xì)胞膜囊泡。 二、紅細(xì)胞膜的制備紅細(xì)胞取材方便，結(jié)構(gòu)簡單，均一性好。此外，還可用放射性核素化學(xué)物、熒光試劑和順磁試劑等對肝細(xì)胞進(jìn)行共價標(biāo)記，以跟蹤肝細(xì)胞膜在分離時的去向。但它的不足之處是這些酶在質(zhì)膜上并不總是均勻的，據(jù)之作出判斷有一定的局限性。 (四) 鑒定 應(yīng)用最廣泛的是利用膜上酶的活力，作為標(biāo)志來鑒定膜的分離情況。超速離心結(jié)束后，收集41％與37％蔗糖溶液界面的致密沉淀。在其上依次鋪加45％(W／W)、41％(W／W)和37％(W／W)的蔗糖溶液，形成不連續(xù)的蔗糖密度梯度。經(jīng)雙層尼龍布過濾后，按圖所示操作(04℃下進(jìn)行)。稱重、剪碎，／，／LCaCl2(簡稱緩沖液A)內(nèi)進(jìn)行勻漿，肝勻漿濃度為10％。(一) 試劑 含有1．0mmol／L NaHCO3的緩沖液，；／L ／L NaHCO3緩沖液；蔗糖溶液濃度分別為70％，45％，41％和37％，％NaCl溶液。min)。min)。 在對照或測定管與空白管中Pi含量的差值，即為Pi轉(zhuǎn)變或ATP的量。 (1) 如表所示步驟加入各試劑后，在30℃恒溫水浴溫育5min，加入琥珀酸或丙酮酸+蘋果酸為底物，繼續(xù)溫育。一般用恒溫水浴搖床即可滿足要求，其速度為90轉(zhuǎn)／min。避光，冷藏保存。 (3) 磷酸測定：10％三氯醋酸(TCA)，Pi儲備液，3mmol／L KH2PO4，／L H2SO4為溶劑；ANSA試劑， (2) 己糖激酶，／L蔗糖，10mmol／LTris 1. 試劑 (1) ATP合成緩沖液：l0mmol／L Tris此外，由于線粒體制備物可保持良好的偶聯(lián)狀態(tài)，一般為2～3h，可進(jìn)行許多測定，尤其是抑制作用的研究。常用的方法是用葡萄糖／己糖激酶捕捉系統(tǒng)，其中由ATP不斷產(chǎn)生ADP，使線粒體維持狀態(tài)，通過Pi的消失測定ATP的形成。在每次實驗結(jié)束，均應(yīng)用乙醇洗去受試物的任何軌跡，再進(jìn)行下次實驗。 由前述可知，用氧電極研究可獲得許多有關(guān)外源化學(xué)物對線粒體作用的資料。 (O／E)這兩種曲線，均表現(xiàn)Ca2+可刺激線粒體的呼吸，而鈣組(R．R)可抑制Ca2+刺激的呼吸。 (C) 用寡霉素(Oligo)可出現(xiàn)同B一樣的軌跡，它的作用機理可能是對ATP酶／合成酶復(fù)合物起抑制作用，表明兩種不同類型的抑制劑可產(chǎn)生對呼吸的相同作用。ADP作為阻斷ADP／ATP易位子的抑制劑也無作用。 (B) 曲線的上半部分是典型的狀態(tài)3向狀態(tài)4過渡的軌跡。再加抗霉素A(Anti—A)可阻斷琥珀酸以后的呼吸鏈。 對AE模式的解釋如下： (A) 魚藤酮(Rot)可抑制NADH連接底物的線粒體呼吸。 1. 分類 常見線粒體抑制劑的分類見表126。 (二) 線粒體呼吸的抑制作用研究 研究線粒體呼吸的抑制作用，在了解線粒體氧化磷酸化作用中起著重要的作用。故可計算出ADP／O比。此外，依據(jù)P／O比也等于ADP／O比，利用線粒體呼吸測定試驗可求出ADP／O比。如果RCR3，可認(rèn)為制備的線粒體失敗。min)。min)；而丙酮酸加蘋果酸為底物，狀態(tài)3的呼吸速率為5lng atom O／(mg蛋白一般琥珀酸為底物，狀態(tài)3的呼吸速率為94ng atom O／(mg蛋白 狀態(tài)3或4的呼吸速率計算：已知呼吸緩沖液的氧濃度為420ng atom O／min，總氧含量為840ng atom，記錄范圍即空氣線至氮氣線為95％，故將總氧含量垂直分為95等分， O。當(dāng)ADP消耗完后，呼吸又回到狀態(tài)4。 (4) RCR的計算： 記錄內(nèi)源性呼吸2min，即狀態(tài)1。表中所示，加人代謝物濃度不一，會引起呼吸速率的改變，其速率限制因素也不一。加試劑時，應(yīng)小心緩慢，不要引起記錄筆的“跳動”。封閉電極室后，使線粒體唯一的氧源是呼吸緩沖液中的溶解氣體。通常，氮氣線是位于記錄儀調(diào)試時的記錄零點，此時電極電壓為零“氮氣線”與“空氣線”位置之差表示緩沖液的氧濃度。數(shù)分鐘后，記錄筆穩(wěn)定在較低的位置。說明電極有污染，可用浸水棉簽清洗。再過5min，記錄儀不應(yīng)漂移，如還在漂移，說明電極有問題。 (4) 穩(wěn)定1~2min后，將記錄儀調(diào)至95％位置。 (2) 按使用說明安裝氧電極，檢查銀和鉑電極應(yīng)有光澤，以及聚四氟乙烯膜完好無損。推薦丙酮酸+蘋果酸，谷氨酸+蘋果酸以及3—羥基丁酸+琥珀酸，其加入量為10~20μl，終濃度高達(dá)5~l0 mmol／L。HCl緩沖液。呼吸功能通常是利用氧電極測定反應(yīng)體系的氧分壓變化來了解線粒體的呼吸狀況。 線粒體所執(zhí)行的各種功能取決于氧化磷酸化過程。五、線粒體功能的測定 制備線粒體的質(zhì)量將受可能的其它亞細(xì)胞器如溶酶體和過氧化體的污染和／或線粒體功能完整性的影響。 用緩沖液重新懸浮沉淀，使終濃度為20mg蛋白／ml，即為亞線粒體制備物。 ④將上清移至另一離心管內(nèi)，以100000g30min離心，沉降亞線粒體顆粒，其沉淀為紅色，外觀與松香類似。 ②用緩沖液重新懸浮沉淀，其濃度約為20mg／ml，用超聲波處理15s，間隙15s，共l min，超聲源為一臺60W功率的超聲發(fā)生器。HCl緩沖液。它含有全部氧化磷酸化的酶類，對于觀察呼吸鏈氧化反應(yīng)、ATPase活性及其它部分的反應(yīng)是十分有用的。 操作要點是熟練，整個制備過程應(yīng)在1h內(nèi)完成。小心去除上層沉淀，收集含有線粒體的中層沉淀；加適量的緩沖液，再離心12 500g 10min，收集沉淀。此步驟應(yīng)注意溫度在04℃，以及由玻管底物抽起杵時，緩慢拉起避免產(chǎn)生真空效應(yīng)，引起線粒體的機械損傷。勻漿速度為1100rpm，用連續(xù)較長的時間依次逐漸將杵伸到玻管的底部。肝臟用濾紙擦干后，稱重。將大鼠(體重200250g)斷頭處死，放盡血液。 四、線粒體的制備 (一) 大鼠肝臟線粒體的制備 所有操作應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。 色譜分析法雖然較前述其他方法需要較長的時間和更多的費用，但可對某些外源化學(xué)物經(jīng)MFO催化的整個生物轉(zhuǎn)化過程及其關(guān)鍵產(chǎn)物有全面了解。紙層析、薄層層析、氣相色譜及高效液相色譜等層析技術(shù)均可采用，其中以氣相色譜和高效液相色譜應(yīng)用最廣。本法靈敏度較高，但由于需要高比活的氚標(biāo)記底物、昂貴的液體閃爍計數(shù)儀和受過訓(xùn)練的專業(yè)人員等，限制了推廣使用。 (3) 氚標(biāo)記放射性測定：利用氚標(biāo)記的有機化合物在MFO催化的羥化過程中，由碳?xì)滏I上脫落的質(zhì)子(proton)來評定MFO活力。芳烴羧化酶活力測定也是用熒光法，其原理是以苯并(a)芘為底物，與待測微粒體溫育一定的時間。由于本法靈敏度較高，將出現(xiàn)較高的對照值，即本底較高。測定隨時間增強的熒光，可反映MFO的活力。直接熒光法常用的底物有7—二氧基香豆素(7ethoxycoumarin)和7二氧基試鹵靈(7ethoxyresomfin)。本法比較靈敏，一般高于可見紫外分光光度法2～3個數(shù)量級，可測出1～30pmol產(chǎn)物生成量／(min這些方法簡便易行，適合大多數(shù)實驗室，但靈敏度不高，對于MFO活力較低的肝外組織不宜采用。 利用可見紫外光光度法，還可測定MFO催化代謝的其他反應(yīng)。 此外，放射測定法可使甲醛測定的靈敏度提高，但需要N甲基14C標(biāo)記的底物。m11，即肝外組織MFO活力較低，其靈敏度有限。對于肝外組織，因甲醛生成速率為2~3nmol甲醛的測定是利用Hantzsch反應(yīng)，用乙酰丙酮和銨離子捕捉甲醛，形成有色的衍生物。 (1) 可見紫外分光光度法：利用分光光度法評定MFO活力，應(yīng)用最廣泛的方法之一是甲醛生成量的測定，原理是依據(jù)MFO所催化的N和O脫烷基反應(yīng)，許多底物如芐甲苯丙胺與氨基比林(N脫甲基)和可待因(N脫甲基和O脫甲基)等經(jīng)過脫甲基作用后，皆有甲醛生成。由于其底物特異性不強，催化反應(yīng)類型較多，目前已建立多種產(chǎn)物的檢測方法?？梢妰烧卟町愝^大，即其底物轉(zhuǎn)變量小于1％，與測量方法本身的誤差相近，難于進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 3. MFO催化代謝產(chǎn)物的測定 通過直接測定特定底物的消耗進(jìn)行MFO活力評定存在一定的困難，因為其大多數(shù)底物的米氏常數(shù)(km)～／L，~例如，在微粒體制備過程中，難免有觸酶(catalase)的污染，觸酶催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧。 2. 氧耗測定法 采用氧電極法測定反應(yīng)體系中的氧耗量，通過化學(xué)計量法間接了解MFO活力的反應(yīng)體系中，NADPH需要保持恒定的水平，故常用NADPH生成系統(tǒng)，如葡萄糖6磷酸／葡萄糖6磷酸脫氫酶或異檸檬酸／異檸檬酸脫氫酶等來滿足需要。但在重組酶系中，即由各種純化的MFO組分在體外條件下組成的反應(yīng)體系，例如，由細(xì)胞色素P450的某亞型、NADPH—細(xì)胞色素P450還原酶和磷脂組成的細(xì)胞色素P450重組系統(tǒng)，可避免準(zhǔn)確性和專一性不足的缺點。本法是測定反應(yīng)體系中NADPH總消耗量，但在微粒體制備物中，不僅MFO催化反應(yīng)需要消耗NADPH。HCI緩沖液，／L KCl和10mmol／L MgCl2，；~ /ml。本法是利用雙光束分光光度計測定340nm處光密度的變化量。 (二) 代謝法 代謝法可分為NADPH消耗量測定、氧耗測定和MFO催化代謝產(chǎn)物生成量測定。 如上所述，直接法可判斷外源化學(xué)物對MFO催化是否具有誘導(dǎo)作用或抑制作用。因此，通用細(xì)胞色素C作為人工電子受體，來測定這種微粒體黃素蛋白酶。2. NADHP細(xì)胞色素P450還原酶測定 NADHP細(xì)胞色素P450還原酶在MFO作用中起提供電子的作用。此法可快速測定樣品的總細(xì)胞色素P450含量，即各種細(xì)胞色素P450同工酶(或稱亞型)的總和。 (2) 試劑：／；一氧化碳(氣體)；連二亞硫酸鈉 (3) 步驟： ①／； ②加小量固體的連二亞硫酸鈉，(sodium dithionite，Na2S2O4)迅速混勻； ③分裝人兩個比色杯中，用一氧化碳?xì)怏w向比色杯輕輕吹泡l min，開始在450nm和490nm波長處測定其光密度值。 (1) 儀器：雙光束可記錄的分光光度計。其最大特點是還原型CytP450與一氧化碳結(jié)合后，在450nm處有最大吸收光譜，因此被稱為CytP450。由于MFO作用的復(fù)雜性以及成分的多樣性，通常認(rèn)為使用單一方法進(jìn)行MFO的評價不夠全面和可靠，因此，在毒理學(xué)中是采用多種檢測分析方法，從不同角度進(jìn)行MFO作用的評定。直接法是直接測定MFO的各組成成分，如細(xì)胞色素P450含量等。應(yīng)注意所有操作應(yīng)在0~4℃下進(jìn)行，對于組織應(yīng)盡量除去血紅蛋白，較好的方法是臟器的原位灌流。其解決的辦法有：①小腸上皮細(xì)胞可由打開的小腸內(nèi)面刮取或用機械振蕩來與小腸結(jié)締組織分離；②加入胰蛋白酶的抑制劑使蛋白酶活性降低或加入甘油或二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)保護(hù)酶活性；③加肝素防止凝集和蛋白聚集。對于結(jié)締組織較多的肺、皮膚等臟器和對于小腸微粒體的制備較為麻煩。 (二) 肝外組織微粒體的制備 肝微粒體制備過程中的一般性規(guī)則對于肝外組織同樣適用。等電點沉淀法是利用pH改變，使微粒體沉淀出來，在較低離心條件下，10000g l0min，即可制得微粒體。其方法是在去線粒體的上清液中加入鈣離子，使其終濃度為8mmol／L CaCl2，此時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分產(chǎn)生鈣依賴性聚集，在較低的離心條件，2000~25 000g，20min即可將其沉淀。凝膠過濾法不適于做多個樣品。應(yīng)強調(diào)的是貯存方式和時間對微粒體酶的活性或特征會有不同程度的影響。沉淀即微粒體，懸浮于10mmol／L Hepes 肝勻槳離心，10000g 20 min 上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去在第一次離心去除線粒體、核等物質(zhì)時，離心管上層漂浮有脂質(zhì)層，應(yīng)用吸管將其除去，再收集上清液。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。 (一) 肝微粒體制備 1. 以斷頭方法處死動物，迅速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水或勻漿介質(zhì)洗凈血污，剪去粘連的組織，用濾紙輕輕吸干表面水分，稱重。 二、微粒體的制備 微粒體(microsome)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨立的細(xì)胞器。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448。d)，大鼠80mg／(kg 2. p萘黃酮(βnaphthoflavone) 它是多環(huán)芳烴類的誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448，同類誘導(dǎo)物還有3甲基膽葸(3methylcholanthrene)。還可以將藥溶于飲水，1ng／ml，大約7天后，可達(dá)到誘導(dǎo)效果。d)，大鼠100mg／(kg (四) 微粒體酶的誘導(dǎo)方法 1. 苯巴比妥鈉 它是常用的誘導(dǎo)劑之一。此外，為避免晝夜節(jié)律影響，每次實驗應(yīng)在相同時間處死動物。盡快取出所需臟器，如肝、腎、肺及腦等，置人冰的勻漿介質(zhì)中。應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。此緩沖液在4℃條件下，至少貯存12周不變質(zhì)。 ／L KCl的50mmol／L Tris蔗糖為經(jīng)典亞細(xì)胞組分分離研究所選用，而氯化鉀更適合外