論小麥高分子量谷蛋白14亞基hmw-gs14基因的原核表達(dá)(編輯修改稿)
2025-02-17 16:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 冷卻 1～ 2min；加入 800ul LB液體培養(yǎng)基， 37℃ ， 180rpm，振搖培養(yǎng) 1h，使菌復(fù)蘇；吸取適當(dāng)體積（ 80ul）的已轉(zhuǎn)化細(xì)胞，均勻地涂布到LB固體培養(yǎng)基上（含卡那霉素 50ug/ml）； 37℃ ，倒置培養(yǎng) 12～ 14h。 6. 菌落 PCR ? 從 ，隨即挑取數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)單菌落，將其一部分進(jìn)行菌落 PCR，以篩選陽性克??；對應(yīng)部分轉(zhuǎn)印至新的平板上（含卡那霉素 50ug/ml）， 37℃ ，倒置培養(yǎng) 12～ 16h。 ? 在 10ul總反應(yīng)體積中，加入 ddH2O 7ul、 10 buffer 1ul、引物 P014和 P024各 （濃度為 mmol/L）、甘油 1ul以及 Taq DNA聚合酶 （ 1U），進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 PCR程序?yàn)椋?95℃ 預(yù)變性 5min、 95℃ 變性 50sec、55℃ 退火 50sec、 72℃ 延伸 30sec、 72℃ 延伸 10min、4℃ forever 。共 25個(gè)循環(huán)。 ％瓊脂糖凝膠電泳觀察記錄結(jié)果，篩選出陽性克?。ê亟M表達(dá)質(zhì)粒 pETHMW）。 pETHMW的提取 與酶切鑒定 ? 同步驟 pETHMW做 EcoRⅠ 和SalⅠ 雙酶切處理， ％瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結(jié)果。 pETHMW轉(zhuǎn)化 表達(dá)宿主菌 ? 將鑒定好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Rosetta(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞，操作方法如 。將適當(dāng)體積的已轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻地涂布在平板上（含卡那霉素 50ug/ml、氨卞青霉素 25ug/ml）， 37℃ ，倒置培養(yǎng) 12～ 14h。 SDSPAGE分析 ? 挑取含重組表達(dá)質(zhì)粒 pETHMW的陽性單克隆，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中（含 Kan 50ug/ml、 Cm 25ug/ml），于 37℃ ， 180rpm振搖培養(yǎng) 12～ 14h；按 1： 100稀釋加入到 5ml LB液體培養(yǎng)基中（含 Kan 50ug/ml、 Cm 25ug/ml）；振搖培養(yǎng)至 OD600值為 ，加入 IPTG至終濃度為 ；繼續(xù)于 37℃ 振搖培養(yǎng) 4～ 5h。 ? 12022rpm ， 離心 30sec, 收 集 菌 體 ； 加 入 1 SDS loading buffer【 50mM Tris－ Cl()、 100mM DTT、2％ SDS、 ％ 溴酚蘭 、 10％ 甘油 】 重懸沉淀；煮沸10min， 12022rpm， 離心 5min， 取上清 ， 置于 4℃ 備用 。將誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng) SDSPAGE（ 凝膠配置如表 1） 分析 ， 用考馬斯亮藍(lán) R250染色 6h左右；然后 ， 先用高甲醇脫色液脫色 1～ 2h， 再用低甲醇脫色液脫色至背景清晰為止 。 表 1 聚丙烯酰胺凝膠制備 返回 結(jié)果與分析 ? （一）重組質(zhì)粒 pMD－ HMW的酶切鑒定 ? （二）菌落 PCR ? （三）重組表達(dá)質(zhì)粒 pETHMW的雙酶切鑒定 ? （四）表達(dá)產(chǎn)物的 SDSPAGE分析 （一）重組質(zhì)粒 pMD－ HMW的酶切鑒定 ? 重組質(zhì)粒 pMD－ HMW經(jīng) EcoRⅠ 和 SalⅠ 雙酶切處理后，進(jìn)行 1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，重組質(zhì)粒 pMD－ HMW理論上應(yīng)切出兩條帶，分別為 HMWGS14基因（長約 ）以及空克隆載體 pMD18（長約 ）。 （二）菌落 PCR ? EcoRⅠ 和 SalⅠ 雙酶切處理后的 pET30a(+)和回收的HMWGS14基因進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌 Rosetta(DE3)pLysS 后，用引物 P01 P024進(jìn)行菌落 PCR。陽性克隆能擴(kuò)增出長約 400bp的片段。 （三）重組表達(dá)質(zhì)粒 pETHMW的雙酶切鑒定 ? 重組表達(dá)質(zhì)粒 pETHMW理論上應(yīng)切出兩條帶，分別為HMWGS14基因（長約 ）和空載體 pET30a (+)（長約 ）
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