原核生物的基因表達(dá)與操作(編輯修改稿)
2025-01-17 15:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫 (42℃) 時(shí)， cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。 常用原核表達(dá)載體 ? 含 Lac啟動(dòng)子 的表達(dá)載體，如 pOP20313。 ? 含 trp啟動(dòng)子 的表達(dá)載體，如 pDR720。 ? 含 tac啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如 pKK2233。 ? 含 PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體，如 pPLλ 。 ? 分泌蛋白表達(dá)載體 ? 融合型表達(dá)載體： 融合蛋白 ? 非融合型表達(dá)載體： 天然完整蛋白 ? 分泌型表達(dá)載體： 產(chǎn)物可跨膜分 泌至胞周間隙 提高蛋白的表達(dá)量 選擇合適載體，提高翻譯水平 ? 強(qiáng)啟動(dòng)子 提高轉(zhuǎn)錄水平 ? 核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ ATGSD） ? 避免產(chǎn)物降解 ：分泌 /融合表達(dá) 細(xì)菌蛋白酶抑制劑 選擇合適宿主 ? Lac 啟動(dòng)子 LacI菌 ? PL啟動(dòng)子 cI857 溶源菌 誘導(dǎo)表達(dá) ? 溫度誘導(dǎo) PL ? IPTG的化學(xué)誘導(dǎo) Plac、 Ptac 提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解 ? 若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見密碼子，可對(duì) 外源基因進(jìn)行定點(diǎn)突變 或?qū)?宿主細(xì)菌進(jìn)行改造 。 非融合蛋白的表達(dá) 非融合蛋白： 指所表達(dá)的外源蛋白的 N端或 C端不含任何其他氨基酸。 所表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的 mRNA的 AUG為起始，在其氨基 端不含細(xì)菌多肽序列。 P SD Foreign DNA 非融合型表達(dá)載體 非融合基因 非融合型蛋白表達(dá) 非融合蛋白特點(diǎn)： ? 表達(dá)時(shí)要求高： SD序列與 ATG的距離要 合適 。即使改變 23個(gè)堿基，表達(dá)效率也 會(huì)大受影響。 ? 優(yōu)點(diǎn)：能夠較好地保持原來蛋白的活性。 ? 缺點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)容易被蛋白酶降 解，蛋白產(chǎn)量低；分離純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 成本較高。 非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法： ? 選用 Ion（黃嘌呤核苷）營養(yǎng)缺陷 型宿主菌 ? 利用細(xì)菌蛋白酶抑制劑 融合蛋白： 是指蛋白質(zhì)的 N末端由原核 DNA 序列或其他 DNA序列編碼， C端由 真核 DNA的完整序列編碼。這樣 的蛋白質(zhì)有一段短的原核多肽或 具有其他功能的多肽和真核蛋白 質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。 融合蛋白的表達(dá)及純化 融合型蛋白表達(dá) P SD Foreign DNA 融合型表達(dá)載體 融合基因 融合蛋白的表達(dá)及純化 構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體：在外源蛋白的 N或 C端加標(biāo)記物（如 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物 、 6組氨酸標(biāo)記物、 Fl
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