原核生物的基因表達與操作(編輯修改稿)
2025-01-17 15:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 動子轉(zhuǎn)錄。在高溫 (42℃) 時， cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動子轉(zhuǎn)錄。 常用原核表達載體 ? 含 Lac啟動子 的表達載體，如 pOP20313。 ? 含 trp啟動子 的表達載體，如 pDR720。 ? 含 tac啟動子的表達載體，如 pKK2233。 ? 含 PL啟動子的表達載體，如 pPLλ 。 ? 分泌蛋白表達載體 ? 融合型表達載體： 融合蛋白 ? 非融合型表達載體： 天然完整蛋白 ? 分泌型表達載體： 產(chǎn)物可跨膜分 泌至胞周間隙 提高蛋白的表達量 選擇合適載體，提高翻譯水平 ? 強啟動子 提高轉(zhuǎn)錄水平 ? 核糖體結(jié)合位點（ ATGSD） ? 避免產(chǎn)物降解 ：分泌 /融合表達 細菌蛋白酶抑制劑 選擇合適宿主 ? Lac 啟動子 LacI菌 ? PL啟動子 cI857 溶源菌 誘導表達 ? 溫度誘導 PL ? IPTG的化學誘導 Plac、 Ptac 提高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主降解 ? 若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見密碼子，可對 外源基因進行定點突變 或?qū)?宿主細菌進行改造 。 非融合蛋白的表達 非融合蛋白： 指所表達的外源蛋白的 N端或 C端不含任何其他氨基酸。 所表達的蛋白質(zhì)以真核蛋白的 mRNA的 AUG為起始，在其氨基 端不含細菌多肽序列。 P SD Foreign DNA 非融合型表達載體 非融合基因 非融合型蛋白表達 非融合蛋白特點： ? 表達時要求高： SD序列與 ATG的距離要 合適 。即使改變 23個堿基，表達效率也 會大受影響。 ? 優(yōu)點：能夠較好地保持原來蛋白的活性。 ? 缺點：在宿主細胞內(nèi)容易被蛋白酶降 解，蛋白產(chǎn)量低；分離純化費時費力， 成本較高。 非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法： ? 選用 Ion（黃嘌呤核苷）營養(yǎng)缺陷 型宿主菌 ? 利用細菌蛋白酶抑制劑 融合蛋白： 是指蛋白質(zhì)的 N末端由原核 DNA 序列或其他 DNA序列編碼， C端由 真核 DNA的完整序列編碼。這樣 的蛋白質(zhì)有一段短的原核多肽或 具有其他功能的多肽和真核蛋白 質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。 融合蛋白的表達及純化 融合型蛋白表達 P SD Foreign DNA 融合型表達載體 融合基因 融合蛋白的表達及純化 構(gòu)建融合蛋白表達載體：在外源蛋白的 N或 C端加標記物（如 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶標記物 、 6組氨酸標記物、 Fl
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