原核生物的基因表達(dá)與操作-資料下載頁(yè)
2024-12-30 15:23本頁(yè)面
【正文】 是有助于蛋白質(zhì)的 轉(zhuǎn)運(yùn) 2. 有可能形成包含體 胞外表達(dá) ? 使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化。 途徑： 1. 用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分 泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。 （不是特別有效的程序） 2. 誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏， 導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。 （可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)） 優(yōu)點(diǎn)： 1. 蛋白質(zhì)的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少， 因此目標(biāo)蛋白容易純化 3. 增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用 缺點(diǎn)： 1. 在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真 核蛋白質(zhì)，通常是不會(huì)分泌到胞 外培養(yǎng)基中去的 2. 由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白 質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的 純化過(guò)程比較復(fù)雜 原核生物表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 包含體蛋白的提取 蛋白質(zhì)的復(fù)性 蛋白質(zhì)的純化 蛋白質(zhì)的 PEG化 蛋白質(zhì)的質(zhì)量檢測(cè) 包含體蛋白的提取 細(xì)菌的收獲 包含體的洗滌 破碎 離心 包含體蛋白的變性（溶解） 蛋白質(zhì)的復(fù)性及純化 （ %以下的中性去污劑，如 Tween20） （變性劑：尿素、鹽酸胍 提高 PH、溫度及離子強(qiáng)度） （超聲破碎、機(jī)械破碎、化學(xué)方法破碎） （ 500010000g） 蛋白質(zhì)的復(fù)性 通過(guò)緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度 4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開(kāi)始，到 2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從 4M開(kāi)始，到 時(shí)復(fù)性過(guò)程已經(jīng)結(jié)束。 復(fù)性中常采用的方法： 稀釋復(fù)性 、透析復(fù)性、 超濾復(fù)性、 柱上復(fù)性等。 蛋白質(zhì)的純化 層析類型 離子交換層析 親和層析 疏水作用層析 反相作用層析 凝膠排阻層析 經(jīng)向?qū)游龇蛛x技術(shù) 蛋白質(zhì)的 PEG化 ? 聚已二醇（ polyethylene glycol， PEG） 是一種不帶電的線性親水分子，它可以與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，形成空間構(gòu)象上的屏障，從而避免外源蛋白的抗原決定簇誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體；甚至可以阻止抗體與之結(jié)合。 ? 在蛋白質(zhì)的 PEG化過(guò)程中，最關(guān)鍵的問(wèn)題是確定最佳修飾程度和選用合適相對(duì)分子質(zhì)量的PEG。 原核表達(dá)蛋白的質(zhì)量控制 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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