【文章內(nèi)容簡介】 因子指導 RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合 。 單林娜 制作 64 大腸桿菌中的各種 σ 因子比較 σ 因子 編碼基因 主要功能 σ 70 rpoD 參與對數(shù)生長期和大多數(shù)碳代 謝過程基因的調(diào)控 σ 54 rpoN 參與多數(shù)氮源利用基因的調(diào)控 σ 38 rpoH 分裂間期特異基因的表達調(diào)控 σ 32 rpoS 熱休克基因的表達調(diào)控 σ 28 rpoF 鞭毛趨化相關(guān)基因的表達調(diào)控 σ 24 rpoE 過度熱休克基因的表達調(diào)控 單林娜 制作 65 ? 溫度較高 ,誘導產(chǎn)生各種熱休克蛋白 由 σ 32參與構(gòu)成的 RNA聚合酶與熱休克應(yīng)答基因啟動子結(jié)合 ,誘導產(chǎn)生大量的熱休克蛋白 ,適應(yīng)環(huán)境需要 ? 枯草芽孢桿菌芽孢形成 有序的 σ 因子的替換 ,RNA聚合酶識別不同基因的啟動子 ,使芽孢形成有關(guān)的基因有序地表達 單林娜 制作 66 降解物對基因活性的調(diào)節(jié) ? 通過正調(diào)控以提高基因轉(zhuǎn)錄水平 ,使它由原來的低水平表達變成高水平表達 。 ? 如 :乳糖操縱元除負控誘導機制外 ,還存在一種正控調(diào)節(jié)機制 ,它受到分解代謝產(chǎn)物的阻抑作用 ,又稱作降解物抑制作用或葡萄糖效應(yīng) 。 ? 降解物抑制作用是通過提高轉(zhuǎn)錄強度來調(diào)節(jié)基因表達的 ,是一種積極的調(diào)節(jié)方式 。 單林娜 制作 67 ? 降解物抑制作用產(chǎn)生的原因如下 :細胞內(nèi)存在一種降解物激活蛋白 CAP。 它與cAMP結(jié)合后才能與啟動基因結(jié)合 ,從而促進 RNA聚合酶與啟動基因的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄 。 單林娜 制作 68 弱化子對基因活性的影響 ? 弱化子 :位于結(jié)構(gòu)基因前導區(qū)的終止子 ,它能使轉(zhuǎn)錄終止 。 ? 在這種調(diào)節(jié)方式中 ,起調(diào)節(jié)作用的信號分子的是細胞中某一氨基酸或嘧啶的濃度 。 弱化作用是更為精細的調(diào)節(jié)機制 。 單林娜 制作 69 ? 屬于這種調(diào)節(jié)方式的有大腸桿菌的色氨酸操縱元 、 丙氨酸操縱元 、 蘇氨酸操縱元 、異亮氨酸操縱元 、 纈氨酸操縱元以及沙門氏菌的組氨酸操縱元和亮氨酸操縱元 、 嘧啶合成操縱元等等 。 單林娜 制作 70 ? 在細菌面臨緊急狀況時 ,如氨基酸饑餓時 ,不是缺少一二種氨基酸 ,而是氨基酸的全面匱乏 ,細菌將會產(chǎn)生一個應(yīng)急反應(yīng) ,此時生產(chǎn)各種 RNA、糖 、 脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學反應(yīng)過程均被停止 。 單林娜 制作 71 ? 實施這一應(yīng)急反應(yīng)的信號是鳥苷四磷酸(ppGpp)和鳥苷五磷酸 (pppGpp)。 產(chǎn)生這兩種物質(zhì)的誘導物是空載 tRNA。 空載 tRNA會激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶 ,使 ppGpp大量合成 。 單林娜 制作 72 基因表達調(diào)控的基本概念 原核基因調(diào)控機制 乳糖操縱元 色氨酸操縱元 其他操縱元 Chapter 9 Controlling of the Gene Expression(Part One) 單林娜 制作 73 乳糖操縱元 (lac operon) 內(nèi)容提要 : 乳糖操縱元的結(jié)構(gòu) 酶的誘導 ── lac體系受調(diào)控的證據(jù) 乳糖操縱元調(diào)控模型 影響因子 單林娜 制作 74 一、乳糖操縱元的結(jié)構(gòu) i基因 P O lacZ lacY lacA 阻遏 基因 CAP 啟動子 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因 代謝激活蛋白結(jié)合位點 單林娜 制作 75 乳糖操縱元的結(jié)構(gòu) LacZ LacI LacA LacY 1040 3510 780 825 82 repressor βgalactosidase permease transacetylase 單林娜 制作 76 圖 Lac操縱元及各組分詳圖 單林娜 制作 77 乳糖操縱元的結(jié)構(gòu) 1) 結(jié)構(gòu)基因 : 分解乳糖的三種酶 ,使乳糖分解 ,產(chǎn)生能量。 2) 操縱基因 3) 啟動子 4) CAP 5) i基因 :上游 ,產(chǎn)生阻遏物。 單林娜 制作 78 結(jié)構(gòu)基因 ? lacZ編碼 β 半乳糖苷酶 :將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖 ? lacY編碼 β 半乳糖苷透過酶 :使外界的 β 半乳糖苷 (如乳糖 )能透過大腸桿菌細胞壁和原生質(zhì)膜進入細胞內(nèi) 。 ? lacA編碼 β 半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶 :乙酰輔酶 A上的乙?；D(zhuǎn)到 β 半乳糖苷上 ,形成乙酰半乳糖 。 Two physiologically important reactions catalyzed by βgalactosidase 169。 2022 John Wiley and Sons Publishers 異乳糖 乳糖 別乳糖 IPTG 結(jié)合 lac阻遏物 —去阻遏 單林娜 制作 81 ? 一些化學合成的乳糖類似物 ,不受 β半乳糖苷酶的催化分解 ,卻也能與 R特異性結(jié)合 ,使 R構(gòu)象變化 ,誘導 lac操縱元的開放 。 例如異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG)就是很強的誘導劑 ,不被細胞代謝而十分穩(wěn)定 。 ? Xgal(5溴 4氯 3吲哚 β半乳糖苷 )也是一種人工化學合成的半乳糖苷 ,可被 β半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物 ,因此可以用作 β半乳糖苷酶活性的指示劑 。 IPTG和 Xgal(分子式見圖 )都被廣泛應(yīng)用在分子生物學和基因工程的工作中 。 單林娜 制作 82 如果某種物質(zhì)能夠促使細菌產(chǎn)生酶而本身又不被分解 ,這種物質(zhì)被稱為義務(wù)誘導物 ,如 IPTG(異丙基 β –D硫代半乳糖苷 )。 義務(wù)誘導物 (gratuitous inducer): CH2 OH CH3 HO O S － C － CH3 H CH3 OH H H H H OH IPTG 單林娜 制作 83 二、酶的誘導 ─ lac體系受調(diào)控的證據(jù) 單林娜 制作 84 乳糖操縱元的雙調(diào)控系統(tǒng) : (1)受乳糖與阻遏蛋白調(diào)控的、可誘導的負調(diào)控系統(tǒng) 。 (2)受 cAMP與 CAP調(diào)節(jié)的、可誘導的正調(diào)控系統(tǒng)。葡萄糖通過調(diào)節(jié) cAMP的合成間接監(jiān)控這一過程。 ? 以此保證大腸桿菌靈活、經(jīng)濟、有效地適應(yīng)外界環(huán)境 ,只有在必需的時候 (只有乳糖 ,沒有葡萄糖 )才啟動乳糖操縱子的表達。 三、乳糖操縱元調(diào)控模型 單林娜 制作 85 (一 )阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié) : (分解代謝 )── 可誘導調(diào)控 (二 )CAP的正性調(diào)節(jié) (三 )協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) 單林娜 制作 86 (一 )阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié) (分解代謝 )── 可誘導調(diào)控 乳糖操縱元調(diào)控模型主要內(nèi)容 阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié) : (分解代謝 )── 負控誘導 單林娜 制作 87 乳糖操縱元調(diào)控模型主要內(nèi)容 ① Z、 Y、 A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼 。 ② 該 mNA分子的 啟動區(qū) (P)位于阻遏基因 (I)與操縱區(qū) (O)之間 ,不能單獨起始半乳糖苷酶和透過酶基因的高效表達 。 ③ 操縱子 (operater)是 DNA上的一小段序列 (僅為26bp),是阻遏物的結(jié)合位點 。 ④ 當 阻遏物與操縱基因 結(jié)合時 ,lac mRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制 。 單林娜 制作 88 ⑤ 誘導物通過與阻遏物 結(jié)合 ,改變它的三維構(gòu)象 ,使之不能與操縱基因結(jié)合 ,從而激發(fā) lac mRNA的合成 。 當有誘導物存在時 ,操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù) ,所以啟動子能夠順利起始mRNA的合成 。 乳糖操縱元調(diào)控模型主要內(nèi)容 : 單林娜 制作 89 單林娜 制作 90 RNA聚合酶結(jié)合部位 阻遏物結(jié)合部位 Startpoint of the lac operon Repressor and RNA polymase bind at site that overlap aroud the startpoint of the lac operon 單林娜 制作 91 G C 操縱位點的回文序列 Center of symmetry 單林娜 制作 92 未誘導：結(jié)構(gòu)基因被阻遏 阻遏物 四聚體 LacI P O lacZ lacY lacA 圖 當無誘導物時阻遏物結(jié)合在操縱基因上 單林娜 制作 93 誘導：基因被打開 β 半乳糖苷酶 透性酶 乙酰轉(zhuǎn)移酶 圖 誘導物和阻遏物成為調(diào)節(jié)操縱元的開關(guān) 單林娜 制作 94 阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié) : (分解代謝 )── 負控誘導 1) 無乳糖存在時 ,阻遏物可以結(jié)合在操縱基因上 ─→ 阻止轉(zhuǎn)錄過程 ─→ 基因關(guān)閉 2) 有乳糖存在時 ,乳糖與阻遏物結(jié)合 ─→ 阻遏物變構(gòu) ─→ 阻遏物不能結(jié)合操縱基因 ─→ 轉(zhuǎn)錄進行 ─→ 基因開放 單林娜 制作 96 ? 可誘導調(diào)控的操縱元 ,其基因表達產(chǎn)物都是利用某種營養(yǎng)物的酶體系 (分解代謝 ) 有營養(yǎng)物 ──相應(yīng)基因開放 無營養(yǎng)物 ──細胞就沒必要產(chǎn)生相應(yīng)的酶 單林娜 制作 97 1． 調(diào)控機理 : ? CAP:Catabolite activator protein,分解代謝活化劑蛋白 ,由活化劑基因 (A)編碼 。 也叫 環(huán)腺苷酸受體蛋白 (cAMP receptor protein, CRP)。 (二 )CAP的正性調(diào)節(jié) 單林娜 制作 98 ? cAMP:Cyclic AMP ? ATP 在腺苷酸環(huán)化酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)腺苷酸 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP)。 單林娜 制作 99 The adenyl cyclasecatalyzed synthesis of cyclic AMP (cAMP) from ATP 169。 2022 John Wiley and Sons Publishers 單林娜 制作 100 ? CAP有 2種狀態(tài) : ?無活性態(tài) :CAP未與 cAMP結(jié)合時是沒有活性的 ,不能與 特定的 DNA序列 結(jié)合 。 ?活性態(tài) : CAP與 cAMP結(jié)合后 ,發(fā)生空間構(gòu)象的變化而活化 ,能以二聚體的方式與 特定的 DNA序列 結(jié)合 ,從而增強 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性 ,可使轉(zhuǎn)錄提高 50倍 。 單林娜 制作 101 Z Y A O P DNA 調(diào)控區(qū) CAP結(jié)合位點 啟動序列 操縱序列 結(jié)構(gòu)基因 Z： β 半乳糖苷酶 Y： 透酶 A：乙?；D(zhuǎn)移酶 在 lac操縱元的啟動子 Plac上游端有一段與 Plac部分重疊的序列 , 能與 CAP 特 異 結(jié) 合 , 稱為 CAP 結(jié) 合 位 點(CAP binding site)。 單林娜 制作 102 (二 )CAP的正性調(diào)節(jié) 單林娜 制作 103 在什么條件下 cAMP能夠與 CAP結(jié)合呢 ? 單林娜 制作 104 ? 當葡萄糖濃度高時 ,cAMP濃度降低 ,CAP不能被活化 ,lac操縱元的結(jié)構(gòu)基因表達下降 (如下圖 )。 ? 當葡萄糖濃度低時 ,cAMP濃度升高 ,CAP被活化 ,lac操縱元的結(jié)構(gòu)基因表達上升 (如下圖 )。 單林娜 制作 105 單林娜 制作 106 CAP正調(diào)控的意義 ?葡萄糖 、 乳糖同時存在時 ,葡萄糖先利用 1)有葡萄糖存在時 ,cAMP↓─→cAMP CAP↓,不 能 結(jié) 合 CAP 位 點 上 ,─→ 正 調(diào) 控 作 用↓─→ 乳糖操縱元不能表達 。 (雖然有乳糖存在 ,乳糖操縱元不開放基因 ) 單林娜 制作 107 2)無葡萄糖存在時 ,cAMP↑─→cAMPCAP↑─→正調(diào)控作用 ↑─→基因表達 。 ? CAP正調(diào)控的意義在于保證經(jīng)濟有效地利用碳源 。 ? 對 lac操縱元來說 CAP是正性調(diào)節(jié)因素 ,lac阻遏蛋白 是負性調(diào)節(jié)因素 。 兩種調(diào)節(jié)機制之間是何種關(guān)系呢 ? 單林娜 制作 108 ? CAP和 lac阻遏蛋白 兩種調(diào)節(jié)機制根據(jù)存在的碳源性質(zhì)及水平協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) lac操縱元的表達 。 當阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時 ,CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用 如無 CAP存在 ,即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合 ,操縱元仍無轉(zhuǎn)錄活性 。 cAMP─C