【文章內(nèi)容簡介】 這一特性。 O決定相鄰 Z基因的產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是組成型合成 ,O區(qū)域稱為 操縱基因 。 操縱基因的結(jié)構(gòu) 特點(diǎn) :7+28,以 +11為對(duì)稱軸 典型特征具有反向重復(fù)序列 相互作用位點(diǎn)可以縮小在 +5+17 I P O Z Y A 調(diào)控基因 控制位點(diǎn) 結(jié)構(gòu)基因 DNA 阻遏蛋白 啟動(dòng)序列 cAMPCAP結(jié)合位點(diǎn) 操縱序列 β半乳糖苷酶 通透酶 乙?；D(zhuǎn)移酶 乳糖操縱子 (lactose opron) 結(jié)構(gòu) RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn) (－ 67~－ 59) (－ 7~＋ 28) General anization of the lac operon of wildtype E. coli. Order of controlling elements and genes: lacI: promoterlacIterminator operon: promoteroperatorlacZlacYlacAterminator 54 ─58 65 ─69 47 ─ 8 3 ─ +21 AUG:+39 ─ +41 47 ─ 84 1)PO區(qū) Promotor: 84+ 1 Operator: 7+28 兩者有 7bp重疊 ,使這段序列可能無法同時(shí)結(jié)合RNA聚合酶和阻遏蛋白 ,也可能雖然可以同時(shí)結(jié)合 ,但無法形成開放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 2)Lac阻遏物的作用 負(fù)調(diào)控 mRNA 阻遏蛋白 I DNA Z Y A O P pol 沒有乳糖存在時(shí) 阻遏基因 Lac阻遏物的作用 負(fù)調(diào)控 mRNA 阻遏蛋白 有乳糖存在時(shí) I DNA Z Y A O P pol 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 mRNA 乳糖 別乳糖 β半乳糖苷酶 3)誘導(dǎo)物的作用機(jī)制 a誘導(dǎo)模式 平衡模型 (間接作用 ):DNA結(jié)合的阻遏蛋白和游離的阻遏蛋白迅速平衡 ,加入誘導(dǎo)物后 ,誘導(dǎo)物結(jié)合到游離的阻遏蛋白上 ,打破了平衡 ,從而導(dǎo)致結(jié)合的阻遏蛋白釋放 維持阻遏 過量的阻遏物可結(jié) 合在 D N A 阻遏物結(jié)合在 的其它位點(diǎn) 操縱基因上 a a a a a a a a a 誘導(dǎo)物 a 誘導(dǎo) 所有的阻遏物都結(jié)合 a a 在 D N A 的隨機(jī)位點(diǎn)上 a a a aa 誘導(dǎo) 物解離 a 建立阻遏 阻遏物恢復(fù) 活性狀態(tài) a a a 阻遏蛋白通過直接取代 a 從隨機(jī)位點(diǎn)移向 a 操縱基因 a a a a a a 圖 16 14 在細(xì)胞中所有的阻遏蛋白都結(jié)合在 D N A 上 ( 仿 e w i n: 《 G E N E S 》Ⅵ ,1997, F i g .) 阻遏蛋白從操縱基因上解離下來的速率非常低以至不能和平衡模型相吻合。 b 解離模型 (直接作用 ):誘導(dǎo)物直接和結(jié)合在操縱基因上的阻遏蛋白相互作用。可能通過改變其構(gòu)象使其離開操縱基因。 4)兩個(gè)矛盾 第一個(gè)誘導(dǎo)物如何進(jìn)入細(xì)胞 ? 第一個(gè) β半乳糖苷酶如何產(chǎn)生 ? 解釋 : 本底水平表達(dá) 在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量 (15個(gè) mRNA分子 )lac mRNA合成。由于阻遏物的結(jié)合并不是絕對(duì)緊密 ,即使在與操縱基因緊密結(jié)合時(shí) ,也會(huì)偶爾掉下來 ,這時(shí)啟動(dòng)子的阻礙被解除 ,RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄 ,導(dǎo)致在非誘導(dǎo)情況下少量透過酶可以合成。 －－ mRNA的這種合成稱為 本底水平表達(dá) 。 5)CAPcAMP復(fù)合物在乳糖操縱子表達(dá)中 的作用 乳糖操縱子的 正調(diào)控 1965年 , Sutherland 發(fā)現(xiàn)大腸桿菌培養(yǎng)液中葡萄糖的含量總是與 cAMP含量成反比。 1968年 ,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌培養(yǎng)液中加入 cAMP可增加半乳糖苷酶的產(chǎn)量。 葡萄糖消耗完 ? Adenylate cyclase converts ATP into cAMP. ? Phosphodiesterase converts cAMP to AMP. ? Glucose catabolite may inhibit adenylate cyclase and stimulate Phosphodiesterase ◆ cAMP的作用 : 刺激多種可誘導(dǎo)的操縱子。 cAMP和 CRP結(jié)合后發(fā)揮作用。 ◆ CRP(分解物基因激活物蛋白 ):由 Crp基因編碼 ,有二個(gè)相同亞基的蛋白質(zhì)。其中一個(gè)與 DNA結(jié)合的 domain, 一個(gè)與 cAMP結(jié)合的 domain。 ◆ CRP和 cAMP結(jié)合后 ,稱為 CAP,刺激操縱子 ,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄 (正調(diào)控 )。 ? CAP (catabolite activator protein)以 兩種方法來激活轉(zhuǎn)錄 : (1)它可能直接和 RNA Pol相互作用 。 (2) 作用于 DNA,改變其結(jié)構(gòu) ,從而幫 助 RNA Pol結(jié)合 。 葡萄糖 cAMP Lac操縱子被抑制 + + + + 轉(zhuǎn)錄 無葡萄糖 ,cAMP濃度高時(shí) 有葡萄糖 ,cAMP濃度低時(shí) Z Y A O P DNA CAP CAP CAP CAP CAP CAP cAMPCAP與 DNA相結(jié)合 ,造成雙螺旋彎曲 ,形成一個(gè)“環(huán)狀”結(jié)構(gòu) , lacI+基因產(chǎn)物(阻遏物 )無法與 O區(qū)相結(jié)合 ,易于形成 三元轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 ,只要有這個(gè)“環(huán)”的亞基存在 ,lac operon就可以得到表達(dá)。 cAMPCAP還能直接影響 RNA聚合酶的活性。 6)乳糖操縱子基因表達(dá)的一般情況 基因表達(dá)的外界信號(hào) 基因表達(dá)的 負(fù)調(diào)控 基因表達(dá)的 正調(diào)控 正、負(fù)調(diào)控協(xié)同表達(dá) 葡萄糖、乳糖濃度的變化 Lac阻遏物 與操縱基因 cAMP+CAP與相應(yīng)的 DNA序列 條件 2: 低乳糖 條件 3: 低乳糖 條件 4: 高葡萄糖 低 cAMP 高乳糖 Lac 阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí) , CAP對(duì)該系統(tǒng)不發(fā)揮作用 條件 1: 低葡萄糖 高 cAMP 高乳糖 Lac 阻遏蛋白 不 封閉轉(zhuǎn)錄時(shí) , 沒有 CAP存在 ,也 無高效轉(zhuǎn)錄活性。 Lac 阻遏蛋白不封閉轉(zhuǎn)錄 , CAP+ cAMP 加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。 O O O ※ 當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí) ,CAP對(duì)該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用 。 ※ 如無 CAP加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄 ,即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合 ,操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性。 ※ 若有葡萄糖或葡萄糖 /乳糖共同存在時(shí) ,細(xì)菌首先利用葡萄糖。葡萄糖對(duì) lac 操縱子的阻遏作用稱 分解代謝阻遏 (catabolic repression)。 ※ lac操縱子的誘導(dǎo)作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。 mRNA 無乳糖時(shí) 有乳糖時(shí) 無葡萄糖 cAMP濃度高 有葡萄糖cAMP濃度低 RNApol O O O O lac操縱子基因表達(dá)既需要乳糖又需缺乏葡萄糖 色氨酸操縱子 (tryptophane operon)負(fù)責(zé) 色氨酸的生物合成 ,當(dāng)培養(yǎng)基中有足夠的色氨酸時(shí) ,這個(gè)操縱子自動(dòng)關(guān)閉 ,缺乏色氨酸時(shí)操縱子被打開 ,trp基因表達(dá) ,色氨酸或與其代謝有關(guān)的某種物質(zhì)在阻遏過程 (而不是誘導(dǎo)過程 )中起作用。由于 trp體系參與生物合成而不是降解 ,它不受葡萄糖或 cAMPCAP的調(diào)控。 二 )色氨酸操縱子 色氨酸的合成分 5步完成。每個(gè)環(huán)節(jié)需要一種酶 ,編碼這 5種酶的基因緊密連鎖在一起 ,被轉(zhuǎn)錄在一條多順反子 mRNA上 ,分別以 trpE、 trpD、trpC、 trpB、 trpA代表 ,編碼鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油 3磷酶合成酶。 1. 色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu) ◆ trpR(89’)和 trpABCDE(25’)不緊密連鎖 。 ◆ 操縱基因在啟動(dòng)子內(nèi) ◆ 有衰減子 (attenuator) ◆ 啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因不直接相連 , 二者被前導(dǎo)順序 (Leader)所 隔開 trpE基因是第一個(gè)被翻譯的基因 ,與其相鄰的是前導(dǎo)區(qū) trpL和衰減子 trpa。 trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是 trpR,該基因距 trp基因簇很遠(yuǎn) ,后者在大腸桿菌染色體圖上 25min處 ,而前者則位于90min處。 在位于 65min處還有一個(gè) trpS(色氨酸 tRNA合成酶 ),它和攜帶有 trp的 tRNATrp也參與 trp操縱子的調(diào)控作用。 負(fù)調(diào)控 阻遏系統(tǒng) trpR基因在其自身的啟動(dòng)子作用下 ,合成分子量 47000的調(diào)控蛋白 ,但沒有與 O結(jié)合的活性 ,因此被稱為 輔阻遏蛋白 (aporepressor),除非培養(yǎng)基中有色氨酸。 輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物 ,與操縱區(qū)結(jié)合并使之關(guān)閉轉(zhuǎn)錄 trp mRNA。 高 Trp時(shí)： 輔阻遏物蛋白 +Trp 結(jié)合操縱基因 不轉(zhuǎn)錄 低 Trp時(shí)： 輔阻遏物蛋白 不結(jié)合操縱基因 轉(zhuǎn)錄 Trp 有 Trp 無 Trp mRNA O P trpR 調(diào)節(jié)區(qū) 結(jié)構(gòu)基因 RNA聚合酶 RNA聚合酶 色氨酸操縱子 ◆ 前導(dǎo)區(qū)的序列特點(diǎn) ◆ 轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制 ◆ 衰減機(jī)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù) 前導(dǎo)區(qū) (Leader):結(jié)構(gòu)基因起始密碼子前有 162個(gè)堿基 ,其中的 139個(gè)堿基構(gòu)成前導(dǎo)區(qū)。 ?前導(dǎo)肽 (Leader peptide):推測(cè)前導(dǎo)區(qū) mRNA可編碼 14個(gè)氨基酸 組成的多肽 ,其中第 10和第 11位均為色氨酸。 ?有四個(gè)富含 GC的區(qū)段 ,相鄰的區(qū)段之間可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。 ?弱化子 ( attenuator ): 一段位于結(jié)構(gòu)基因上游前導(dǎo)區(qū) ,具有終止子結(jié)構(gòu)的短序列 ,通過前導(dǎo)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 形成類 似于終止子的二級(jí)結(jié)構(gòu) ,達(dá)到轉(zhuǎn)錄終止的目的。 UUUU…… UUUU…… 調(diào)節(jié)區(qū) 結(jié)構(gòu)基因 trpR O P 前導(dǎo)序列 衰減子區(qū)域 UUUU…… 前導(dǎo) mRNA 1 2 3 4 衰減子結(jié)構(gòu) 第 11密碼子為 trp密碼子 終止密碼子 14aa前導(dǎo)肽編碼區(qū) : 包含序列 1 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)能力強(qiáng)弱 :