論小麥高分子量谷蛋白14亞基hmw-gs14基因的原核表達-閱讀頁
2025-02-05 16:02本頁面
【正文】 2％ SDS、 ％ 溴酚蘭 、 10％ 甘油 】 重懸沉淀；煮沸10min， 12022rpm， 離心 5min， 取上清 ， 置于 4℃ 備用 。 表 1 聚丙烯酰胺凝膠制備 返回 結(jié)果與分析 ? （一）重組質(zhì)粒 pMD－ HMW的酶切鑒定 ? （二）菌落 PCR ? （三）重組表達質(zhì)粒 pETHMW的雙酶切鑒定 ? （四）表達產(chǎn)物的 SDSPAGE分析 （一）重組質(zhì)粒 pMD－ HMW的酶切鑒定 ? 重組質(zhì)粒 pMD－ HMW經(jīng) EcoRⅠ 和 SalⅠ 雙酶切處理后，進行 1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，重組質(zhì)粒 pMD－ HMW理論上應切出兩條帶，分別為 HMWGS14基因（長約 ）以及空克隆載體 pMD18（長約 ）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主菌 Rosetta(DE3)pLysS 后，用引物 P01 P024進行菌落 PCR。 （三）重組表達質(zhì)粒 pETHMW的雙酶切鑒定 ? 重組表達質(zhì)粒 pETHMW理論上應切出兩條帶，分別為HMWGS14基因（長約 ）和空載體 pET30a (+)（長約 ）。取 15ul上樣， SDSPAGE后，考馬斯亮藍 R250染色結(jié)果表明：經(jīng) IPTG誘導，含有重組表達質(zhì)粒 pETHMW的菌株可特異地產(chǎn)生一條與 HMWGS14分子量相當?shù)牡鞍讞l帶。 返回 討 論 ? 大腸桿菌表達宿主菌株 Rosetta(DE3)pLysS是 T7 RNA聚合酶 /啟動子表達系統(tǒng)。 pLysS是帶有可以與 pET共存的、編碼 T7溶菌酶（ T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的質(zhì)粒。 ? pET系列載體是含有 T7噬菌體啟動子的表達載體。它們的典型特點就是帶有 pBR322的大腸菌素 E1（ colE1）復制區(qū)，從而賦予宿主氨卞青霉素或卡那霉素抗性。 ? 基因在 T7RNA聚合酶控制下的表達 ,與依賴大腸桿菌 RNA聚合酶表達系統(tǒng)相比 ,有許多優(yōu)越之處 :首先 T7RNA聚合酶合成 RNA的速度數(shù)倍于大腸桿菌 RNA聚合酶 ,并較少發(fā)生轉(zhuǎn)錄的終止；第二 , T7RNA聚合酶只識別自己的啟動序列 ,不能啟動大腸桿菌 DNA任何序列的轉(zhuǎn)錄；最后 , T7RNA聚合酶對抑制大腸桿菌 RNA聚合酶的抗生素 (如利福平等 )有抗性 ,可使 T7RNA噬菌體啟動子 (PT7)控制下的基因得到充分表達。 ? 本研究中， HMWGS14的表達量較低。二、 HMWGS14分子量高達 89KD，可能會對宿主細胞產(chǎn)生一定的毒性，影響宿主細胞的生長和活力。四、培養(yǎng)溫度對外源蛋白的表達可能也有影響：不同的蛋白對溫度的要求不同，有些蛋白對溫度的變化很敏感；而另外一些，溫度對其的影響不大甚至沒有影響。不同的蛋白對這些條件的要求不同，這需要在實驗中具體地去摸索。 返回 結(jié) 論 ? 成功構(gòu)建了高分子量谷蛋白 14亞基（ HMWGS14）基因的原核表達載體 pETHMW； HMWGS14基因在大腸桿菌表達宿主菌 Rosetta(DE3)pLysS中得到了特異表達。北京，科學出版社， 2022， 8. ? 陸燕、馬傳喜 . 小麥品種麥谷蛋白亞基的遺傳變異分析。 2022， 27（ 2）： 126～ 130 ? 張發(fā)云、晏月明、胡英考、胡贊民、周奕華 . 小麥 HMW谷蛋白亞基基因克隆研究進展 . 中國生物工程雜志 . 2022， 22（ 6）； 33～ 40 ? 馬傳喜、吳兆蘇 . 小麥胚乳蛋白質(zhì)組分及高分子量麥谷蛋白亞基與烘烤品質(zhì)的關系 . 作物學報 . 1993， 19（ 6）： 562～ 567 ? 李育慶、曹凱明、忻驊等 .聚合酶鏈反應（ PCR）所得小麥高分子量谷蛋白亞基基因片段的克隆和順序分析 . 植物學報 . 1992， 34（ 9）： 631～ 637 ? 解瑞立、萬永芳、張彥等。此外， 老師、 老師、 、 老師以及本實驗室的其他師兄師姐們也給了我很大
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