【正文】 持活性。 克服的方法： （ 1）用蛋白酶活性低的菌株作為受體菌。 Ion為 E. coli合成蛋白酶的主要底物。如 T4噬菌體的 pin基因產(chǎn)物。 （七）融合蛋白的表達及純化 指所表達的外源蛋白與一種宿主蛋白共價連接，構(gòu)成融合蛋白。 彼此相差一個堿基。 pPC???Z2的 EcoRI位點之 前多了 2個 G，經(jīng) EcoRI酶切 后的為 GGG； pPC???Z3的 EcoRI位點之 前多了 4個 G，經(jīng) EcoRI酶切 后的為 GGGGG。經(jīng)過進一步的提純，就可以得到完整的胰島素。 現(xiàn)已開發(fā)大量的表達融合蛋白的商業(yè)性載體： 如 Invitrogen公司： 細菌表達系統(tǒng)： pBADHis系列、 pTrcHis系列等， 酵母菌表達系統(tǒng)： 、 pPIC9K等多種 。 限制性內(nèi)切酶 AvaI的應用：表達多個串連基因的表達載體的構(gòu)建 AvaI 單一方向串連排列基因構(gòu)建方法： （ 1）先把含 CTCGGG序列的質(zhì)粒用 AvaI切開，用 DNA聚合酶 I補平，兩端與 EcoRI接頭連接，外源基因的起始和終止子都可以通過 EcoRI位點克隆到載體上； （ 2）然后把這個重組片斷再用 AvaI切出，切出的 DNA片斷兩端的粘性末端不同，因此連接時只能有一個方向； （ 3）由于插入外源基因使用的是單一的 EcoRI位點，因此基因插入的方向有 2個，其中只能有一個能夠表達。 正常情況下蛋白質(zhì)的半衰期：從 幾分鐘 到 幾小時 不等。二硫鍵可以增強蛋白質(zhì)的半衰期； （ 2）所表達的蛋白質(zhì)的 N端 是否有特定的氨基酸。如：在 ?半乳糖苷酶的 N端加上不同的氨基酸，體外存活的時間可以從 2分鐘到 20小時不等。 PEST序列 ：即存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的 Pro（ P）、 Glu（ E）、 Ser（ S） 和 Thr（ T） ，由于在它們的兩端往往存在 帶正電的氨基酸殘基，極易受到蛋白酶的攻擊。 外源基因的整合途徑： （ 1） 轉(zhuǎn)座作用 （包括插入序列）； （ 2） 同源交換 。 大腸桿菌蛋白的途徑： （ 1） N端有分泌信號的蛋白： 信號肽以及一組以 Sec命名的蛋白： SecA、 B、 D、E、 F和 Y等， 一般僅分泌到周質(zhì)空間。 （一）包含體蛋白的提取 包含體蛋白： Inclusion body 在大腸桿菌中當外源蛋白的表達量達到 20％時，由于表達部位的低電勢和外源蛋白分子的特殊結(jié)構(gòu)（如富含 Cys、無糖基化等），使外源蛋白與其周圍的其它雜蛋白及其核酸一起形成的一種不溶性的結(jié)構(gòu)。 第二節(jié) 原核生物表達產(chǎn)物的分離純化 包含體蛋白的提取步驟： （ 1）菌體的收獲、破碎與包含體的洗滌 一般可在 5000～ 10000?g下離心收集菌體，然后進行菌體的破碎。常用洗滌液： ① 1%以下的中性去垢劑，如 Tween、 Triton、 NP40等； ② 可以在中性去垢劑中再添加 EDTA和 二硫蘇糖醇（ DTT）、巰基乙醇 等還原劑，并保持 NaCl的濃度為 50 mM； ③ 低濃度 鹽酸胍 或 中性去垢劑、 EDTA及 還原劑 共同使用。 包含體蛋白的提取步驟： （ 1）菌體的收獲、破碎與包含體的洗滌 一般可在 5000～ 10000?g下離心收集菌體，然后進行菌體的破碎。常用洗滌液： ① 1%以下的中性去垢劑，如 Tween、 Triton、 NP40等； ② 可以在中性去垢劑中再添加 EDTA和 二硫蘇糖醇（ DTT）、巰基乙醇 等還原劑，并保持 NaCl的濃度為 50 mM； ③ 低濃度 鹽酸胍 或 中性去垢劑、 EDTA及 還原劑 共同使用。 （ 2）包含體的融解 包含體是通過 疏水作用力、氫鍵、離子鍵和二硫鍵 等維持的，融解時必須綜合考慮變性劑的濃度、溫度、作用時間、溶液離子強度、 pH值及其蛋白質(zhì)濃度與變性劑的比值等多種復雜因素。但是結(jié)合到外源蛋白上的 SDS分子 很難除去 ，這種蛋白作為藥物使用的話，可能會造成流產(chǎn)；同時少量氧化物的存在會造成外源蛋白的共價修飾，因此目前很多國家的政府機構(gòu)，已經(jīng)禁止用 SDS溶解的蛋白產(chǎn)品上市。一般人們采用 8～ 10 mol/L的尿素溶解包含體，其溶解速度較慢，溶解度為 70－ 90％。目前，尿素已被廣泛用于包含體的溶解。但是，它的缺點就是成本較高，而且除去鹽酸胍會造成較大的蛋白質(zhì)損失，另外，鹽酸胍對于外源蛋白進行進一步的離子交換層析有干擾作用。 通常選擇各蛋白質(zhì)的滴定曲線沒有交叉的 pH值作為緩沖液的 pH值，同時還應考慮該蛋白質(zhì)在該 pH值下的穩(wěn)定性和溶解性； （ 2） 用離子交換層析分離等電點相同但表面電荷分布不同的蛋白質(zhì)。 如酶和底物、抗原和抗體、糖鏈和凝集素等； （ 4）對于具有明顯親水和疏水性的蛋白質(zhì)，可以 選用疏水作用層析和反相作用層析 ； （ 5） 凝膠排阻層析對于除去包含體中的雜蛋白很有效 ：在 E. coli等中表達的外源蛋白相對分子量均在 ?104左右，而且大多數(shù)以包含體的形式存在，而包含體中的雜質(zhì)蛋白的相對分子量通常大于 ?104。 通常選擇各蛋白質(zhì)的滴定曲線沒有交叉的 pH值作為緩沖液的 pH值，同時還應考慮該蛋白質(zhì)在該 pH值下的穩(wěn)定性和溶解性； （ 2） 用離子交換層析分離等電點相同但表面電荷分布不同的蛋白質(zhì)。 如酶和底物、抗原和抗體、糖鏈和凝集素等； （ 4）對于具有明顯親水和疏水性的蛋白質(zhì)，可以 選用疏水作用層析和反相作用層析 ； （ 5） 凝膠排阻層析對于除去包含體中的雜蛋白很有效 ：在 E. coli等中表達的外源蛋白相對分子量均在 ?104左右，而且大多數(shù)以包含體的形式存在，而包含體中的雜質(zhì)蛋白的相對分子量通常大于 ?104。 （三）表達蛋白的 PEG化 對表達的蛋白質(zhì)進行聚乙二醇（ polyethylene glycol, PEG）修飾，以達到降低免疫原性，延長半衰期，保持藥效活性的目的。 用氰尿酰氯活化的 PEG對蛋白質(zhì)的修飾作用