【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的洗脫峰寬度成反比。 第 8 章 離子交換 離子交換常用洗脫方法： 從樹(shù)脂上洗脫目的物的方法主要有兩種： （ 1） 調(diào)節(jié)洗脫液的 pH，使目的物粒子在此 pH 下失去電荷，甚至帶相反電荷，從 而喪失與原離子交換樹(shù)脂的結(jié)合力而被洗脫下來(lái)。 （ 2） 用高濃度的同性離子根據(jù)質(zhì)量作用定律將目的物離子取代下來(lái)。 離子交換樹(shù)脂的命名法。舉兩種樹(shù)脂骨架。 樹(shù)脂命名編號(hào)：強(qiáng)酸類 1~100號(hào)，弱酸類 101~200號(hào)，強(qiáng)堿類 201~300號(hào)，弱堿類 301~400號(hào)，中強(qiáng)酸 401~500。各種樹(shù)脂除注明類別和編號(hào)外，還需標(biāo)明載體的交聯(lián)度。書(shū)寫(xiě)交聯(lián)度時(shí)，將百分號(hào)除去，寫(xiě)在樹(shù)脂編號(hào)后并用乘號(hào)“ X”隔開(kāi)。強(qiáng)酸 1X7，交聯(lián)度為 7%。 樹(shù)脂骨架：（ 1）苯乙烯型離子交換樹(shù)脂 （ 2）丙烯酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 （ 3）多乙烯多胺 —— 環(huán)氧氯 丙烷樹(shù)脂 （ 4）聚乙烯砒啶系離子交換樹(shù)脂 （ 5）其他離子交換樹(shù)脂 蛇籠樹(shù)脂 選擇性離子交換樹(shù)脂 熱再生離子交換樹(shù)脂 離子交換的選擇性的因素：一、離子化合價(jià)與水合半徑的影響 二、離子化合價(jià)與離子濃度的影響 三 |、交換環(huán)境的影響 （ 1）溶液的 pH （ 2）離子強(qiáng)度 （ 3）有機(jī)溶劑 四、樹(shù)脂結(jié)構(gòu)的影響 （ 1）樹(shù)脂載體交聯(lián)度 （ 2）輔助力 （ 3）其他結(jié)合力 五、偶極離子排斥作用。 偶極離子的交換特點(diǎn)：凈電荷為零時(shí)，正電中心和負(fù)電中心并不重疊，遂成偶極。 鈉型樹(shù)脂，被吸附的氨基酸的羧基所帶的負(fù)電荷與樹(shù)脂 磺酸基的負(fù)電荷產(chǎn)生排斥力。偶極離子的排斥作用，所以使樹(shù)脂對(duì)氨基酸的吸附量大大降低。 氫型樹(shù)脂：由于氨基酸的解離度低，被取代之氫離子為羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶極，故與樹(shù)脂磺酸基沒(méi)有排斥力。 偶極離子的排斥力隨氨基酸的 R基碳鏈的加長(zhǎng)而減弱。適當(dāng)增加溶液中離子強(qiáng)度，偶極排斥力減弱。 大孔、均孔樹(shù)脂的特點(diǎn)：大孔型離子交換樹(shù)脂的特征： 1 載體骨架交聯(lián)度高，有較好的化學(xué)和物理穩(wěn)定性及機(jī)械強(qiáng)度。 2孔徑大，不受環(huán)境條件的影響，動(dòng)力學(xué)性能好，抗污染能力強(qiáng)，交換速度快。 3 表面積大，表面吸附能力強(qiáng)，對(duì)大分子物質(zhì)的 交換容量大 4 孔隙率大，比重大，對(duì)小離子的體積交換量比凝膠型樹(shù)脂小。均孔樹(shù)脂的特點(diǎn)：主要為陰離子交換樹(shù)脂，骨架的交聯(lián)度比較均勻，孔徑大小一致，重量和體積交換容量都較高，膨脹度、相對(duì)密度適中、機(jī)械強(qiáng)度好、抗污染和再生能力強(qiáng)。 離子交換纖維素的特點(diǎn)及洗脫。 離子交換纖維素為開(kāi)放的長(zhǎng)鏈骨架，大分子物質(zhì)能自由地在其中擴(kuò)散和交換，親水性強(qiáng)，表面積大，易吸附大分子；交換基團(tuán)稀疏，對(duì)分子的實(shí)際交換容量大；吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不易引起變性；分辨率強(qiáng)，能分離復(fù)雜的生物大分子混合物。 洗脫：對(duì)離子交換纖維素進(jìn)行吸附 后的洗脫一般比從離子交換樹(shù)脂的洗脫緩和。升高環(huán)境的 pH 或是降低環(huán)境的 pH或增加離子強(qiáng)度都能將被吸附物質(zhì)洗脫下來(lái)。 酸堿性蛋白選擇合適的離子交換纖維素。 酸性蛋白質(zhì)（等電點(diǎn)約 pH5），作為一個(gè)陰離子，它的 DEAE纖維素柱層析可在 pH5。 5~9。 0之間進(jìn)行，蛋白質(zhì)和交換劑都是解離的，帶有相反的電荷。在 CM纖維素上層析則需限制在（ ~）之間。堿性蛋白質(zhì)（等電點(diǎn)約 pH8）作為一個(gè)陽(yáng)離子，用羧甲基纖維素層析可在 pH3.~ 進(jìn)行。 離子交換聚焦色譜的原理： （ 1） pH 梯度的形成：色譜聚焦 利用離子交換劑本身的帶電基團(tuán)的緩沖作用，當(dāng)洗脫緩沖液不斷滴到離子交換柱上時(shí)，柱內(nèi)自動(dòng)形成 pH 梯度。 （ 2）蛋白質(zhì)的色譜行為：蛋白質(zhì)所帶電荷取決與他們的等電點(diǎn)和介質(zhì)的 pH 低于它的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，它不與陰離子交換劑結(jié)合，隨洗脫液向下移動(dòng)。 （ 3）聚焦效應(yīng)：當(dāng)一種蛋白質(zhì)在柱上隨洗脫液下移至等電點(diǎn)處，移動(dòng)速度明顯減慢。加上相同的第二個(gè)樣品，它將以洗脫液移動(dòng)的速度下降，直到追到正在慢移的第一個(gè)樣品成分處（聚焦）。然后這兩個(gè)樣品一起下移，往柱下一起洗脫出來(lái)。所有的樣品必須在第一個(gè)樣品峰尚未 被洗脫前加入。 9舉例三種常用離子交換樹(shù)脂和離子交換纖維素。 大孔型強(qiáng)酸型離子交換樹(shù)脂 大孔型弱酸型離子交換樹(shù)脂 大孔型弱堿型離子交換樹(shù)脂 甲基磺酸纖維素 乙基磺酸纖維素 二乙基氨基乙基纖維素 芐基化的 DEAE 纖維素 術(shù)語(yǔ)： CMC：羧甲基纖維素。 DEAEC：二乙氨基乙基纖維素。 PBE94：多緩沖交換劑 尼柯?tīng)査狗匠蹋?m1(1/z1) / m2(1/z2) = K c11/z1 / c21/z2..交換容量： meq/g(毫克當(dāng)量 /克樹(shù)脂 ) 樹(shù)脂再生：使用過(guò)的樹(shù)脂重新獲得使用性能的處理 過(guò)程。 偶極離子排斥：被吸附的氨基酸的羧基所帶的負(fù)電荷與樹(shù)脂之負(fù)電荷產(chǎn)生排斥力。 蛇籠樹(shù)脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型陰離子交換樹(shù)脂中聚合而成的一類樹(shù)脂。 第九章 親和層析 親和層析原理，主要特點(diǎn)。 利用生物體中多數(shù)大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子專一型可逆結(jié)合的特性。 主要特點(diǎn)：經(jīng)過(guò)一此簡(jiǎn)單的處理就可以獲得所需的高純度活性物質(zhì)。對(duì)設(shè)備要求不高，操作簡(jiǎn)便，使用范圍廣，特異性強(qiáng)，分離速度快，分離效果好，分離條件溫和。缺點(diǎn)是吸附劑的通用性較差。 選擇配基的注意點(diǎn)：（ 1）配基與配體由足夠大的親和力（ 2） 配基與配體的結(jié)合應(yīng)是專一的（ 3）配基應(yīng)具有化學(xué)活性。 手臂，其長(zhǎng)短與親和層析的效果的聯(lián)系，為什么。 由于酶的活性中心常是埋藏在其結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，它們與介質(zhì)的空間障礙影響其與親和配基的結(jié)合作用。在載體和配基之間插入手臂，以消除空間障礙，手臂的長(zhǎng)度是有限的，太短不能起消除空間障礙的作用，太長(zhǎng)會(huì)使非特異性性吸附增加。 制作高親和力的親和吸附劑 :提高親和層析效果，固定相的配基和流動(dòng)相的配基具有較強(qiáng)的親和力。配基濃度對(duì)親和力的影響。為了將親和配體和其他物質(zhì)分開(kāi)，在實(shí)際親和層析時(shí)，通常需要阻流值≥ 10。空間障礙的影響：插入適當(dāng)長(zhǎng)度的手臂。配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響。載體孔徑的大小對(duì)吸附劑的親和能力有決定性的作用。微環(huán)境的影響，包括載體及手臂的電性、極性、次級(jí)鍵對(duì)配基親和力的影響。 非專一性吸附包括那些：如何克服。 親和層析中的非專一性吸附有以下情況：（ 1）離子情況 （ 2）疏水基團(tuán) a長(zhǎng)的烴類結(jié)構(gòu)的“手臂” b疏水性配基 （ 3）復(fù)合親和力 確定離子 強(qiáng)度以獲得良好的分離效果 親和層析洗脫方法：（ 1）非專一性洗脫 改變洗脫劑的 pH 以影響電性基團(tuán)的解離程度而洗脫（ 2）特殊洗脫 （ 3）專一性洗脫 競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng) 非競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng) 反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng) 二次作用親和沉淀 :利用在物理場(chǎng)（如 pH、離子強(qiáng)度、溫度和舔加金屬離子等）改變時(shí)溶解度下降，發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基，制備親和沉淀介質(zhì)。親和介質(zhì)結(jié)合目的分子后，通過(guò)改變物理場(chǎng)使介質(zhì)與目標(biāo)分子共同沉淀的方法。 親和膜分離原理及特點(diǎn)：親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是 固定床親和層析的變型。 優(yōu)點(diǎn)：（ 1）傳質(zhì)阻力小，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短，配基利用率高。 （ 20壓降小，流速快，設(shè)備體積小，配基用量低。 缺點(diǎn)：理論塔板很低，吸附和清洗率低。 9 術(shù)語(yǔ)： 親和力：配基對(duì)互補(bǔ)分子間的作用力，是制備高效親和柱的重要參數(shù)。親和吸附劑：載體 —— 配基。配基：在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)。阻流值： Ve/Vo。正洗脫：吸附提取物中的有效成分。負(fù)洗脫：去處提取物中的雜質(zhì)。金屬螯合層析：利用金屬離子的絡(luò)合或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。 有機(jī)染料親和層析：有機(jī)染料如蒽醌化合物和偶氮 化合物具有類似于 NAD+的結(jié)構(gòu)，一些需要核酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對(duì)這些染料具有一定的親和力，將這些染料共價(jià)偶聯(lián)到纖維素或瓊脂等多糖載體上，就制得親和層析柱。 親和錯(cuò)流過(guò)濾： (affinity cross flow filtration)ACFF 將親和層析與超濾技術(shù)結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應(yīng)后，用膜進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾，兼有親和層析與膜過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)。 親和萃?。豪门悸?lián)親和配基的 PEG 為成相聚合物進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的雙水相萃取，可在親和配基的親和作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在 PGE相（上相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇 性。 親和反膠團(tuán)萃取：是指在反膠團(tuán)相中除通常的表面活性劑（如 AOT）外，舔加另一種親水頭部為目標(biāo)分子的親和配基的助表面活性劑，通過(guò)親和配基與目標(biāo)分子的親和結(jié)合作用，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在反膠團(tuán)相的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和反膠團(tuán)萃取分離的選擇性。 第十章 離心技術(shù) 相對(duì)離心力：（ RCF）離心力與重力的比值。用符號(hào)“ g” 或 “ g” 表示。 RCF= 106? N2 r ( g) 離心機(jī)轉(zhuǎn)子有幾種，各自特點(diǎn)。 （ 1）角度轉(zhuǎn)子：機(jī)械強(qiáng)度高，重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平穩(wěn)，壽命長(zhǎng)，管內(nèi)溫度分布均勻，溫差對(duì)流小，離心時(shí)間短，使用方便，但離心管外壁易產(chǎn)生強(qiáng)烈對(duì)流和渦流，同時(shí)管外側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀，形成壁效應(yīng)。 （ 2）水平轉(zhuǎn)子：結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加工困難，機(jī)械強(qiáng)度低，重心高，容量小，低速運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)易搖擺，離心時(shí)間長(zhǎng)，壽命短而價(jià)格高。對(duì)流作用小，“壁效應(yīng)”弱。 （ 3）區(qū)帶轉(zhuǎn)子： Anderson 轉(zhuǎn)子，無(wú)離心管，“十”字隔板將樣品槽分為四個(gè)扇形室。無(wú)壁效應(yīng)，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。配有附屬設(shè)備和儀器，操作過(guò)程復(fù)雜，設(shè)備較貴，但離心機(jī)使用效率 高。 （ 4）垂直管轉(zhuǎn)子：特殊類型的定角轉(zhuǎn)子。離心時(shí)的碰撞及溫差引起的對(duì)流不顯著。顆粒沉降時(shí)間短，可用于差速、密度梯度及等密度離心，用于平衡等密度離心時(shí)效果最佳。 （ 5）連續(xù)離子轉(zhuǎn)子：低速或高速離心機(jī)轉(zhuǎn)子，可用于超速離心機(jī)。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，低速時(shí)加樣，高速時(shí)排出清夜。用于實(shí)驗(yàn)室，也可用于小規(guī)模生產(chǎn)，最適宜自培養(yǎng)液中收集菌體及細(xì)胞。 （ 6）細(xì)胞洗脫轉(zhuǎn)子：低速離心時(shí)連續(xù)分離型轉(zhuǎn)子，最高轉(zhuǎn)速不超過(guò) 6000r/min。最適于自動(dòng)植物培養(yǎng)液或發(fā)酵液中連續(xù)分離單細(xì)胞和菌體，回收濃度及回收率均較高。 速度區(qū)帶離心的特點(diǎn)及其用 途：離心操作時(shí)將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線形或非線形密度梯度液上，控制離心時(shí)間，使所需組分通過(guò)部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達(dá)到其等密度區(qū)之前即停止離心。 速度區(qū)帶離心的特點(diǎn)：（ 1）樣品加于梯度介質(zhì)的頂步、離心時(shí)間需嚴(yán)格控制。（ 2）介質(zhì)的密度需嚴(yán)格掌握：梯度最大值≤組分最小密度（ 3）樣品的密度 梯度密度最小值 (4)分離依據(jù)是各組分之沉降系數(shù)差（ 5）分辨率受組分沉降系數(shù)、離心時(shí)間、顆粒擴(kuò)散系數(shù)、介質(zhì)黏度及梯度范圍和形狀的影響。本法適于分離顆粒大小不同而密度相近的組分，如 DNA 與 RNA 混合物、核蛋白體亞單位及線 粒體、溶酶體及過(guò)氧化酶體。 差分離心的特點(diǎn)、用途。 原理是依據(jù)不同大小和密度的顆粒在離心力場(chǎng)中沉降速度的差異進(jìn)行離心分離。所得的沉淀物只具有相對(duì)純度而不具有絕對(duì)均一性。 密度梯度的設(shè)計(jì)包括：（ 1）密度梯度介質(zhì)的選用（ 2）梯度的密度范圍（ 3）梯度的形狀 （ 4）梯度的容量、（ 5）直線型梯度的斜率 “密度梯度”通常的制備方法：（ 1）不連續(xù)梯度的制備、（ 2）混合梯度法（ 3）離心平衡法 梯度的取出與收集的方法：（ 1）底部穿刺法（ 2）頂步收集法 取代法 虹吸法 （ 3）切割法 凍結(jié)切割法 聚合切割法 8術(shù)語(yǔ) 區(qū)帶轉(zhuǎn)子： Anderson 轉(zhuǎn)子，無(wú)離心管，“十”字隔板將樣品槽分為四個(gè)扇形室。無(wú)壁效應(yīng)，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。 角度轉(zhuǎn)子：定角轉(zhuǎn)子 速度區(qū)帶離子法：離心操作時(shí)將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線形或非線形密度梯度液上，控制離心時(shí)間，使所需組分通過(guò)部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達(dá)到其等密度區(qū)之前即停止離心。 差分離心：差速離心。原理是依據(jù)不同大小和密度的顆粒在離心力場(chǎng)中沉降速度的差異進(jìn)行離心分離。所得的沉淀物只具有相對(duì)純度而不具有絕對(duì)均一性。 等密度離心法：離心平衡法，在離心力的作用下，不同 密度的多組分顆粒在梯度介質(zhì)中“向上”或“向下”移動(dòng)。當(dāng)移動(dòng)至其密度與介質(zhì)密度相等的位置便不再移動(dòng)，形成靜止區(qū)帶，即達(dá)到離心平衡。 第十一章 過(guò)濾和膜分離技術(shù) 用于制作透析膜的材料所應(yīng)具有的特點(diǎn)： （ 1） 在使用的溶劑介質(zhì)中能形成具有一定孔徑的分子篩樣薄膜。由于介質(zhì)一般為水，所以膜材料應(yīng)具有親水性，它只允許小分子溶質(zhì)通過(guò)。 （ 2） 在化學(xué)上呈惰性。 不具有與溶質(zhì)、溶劑起作用的基團(tuán)。 （ 3） 有良好的物理性能。包括一定的強(qiáng)度和柔韌度，不易破裂，有良好的再生性能，便于多次重復(fù)使用。 透析裝置的類型：（ 1）旋轉(zhuǎn)透析器 （ 2）平面透析器 （ 3）連續(xù)透析器 （ 4）淺流透析器 克服濃差極化現(xiàn)象的措施： 克服極化的主要措施有振動(dòng)、攪拌、錯(cuò)流、切流等技術(shù)，但應(yīng)注意過(guò)于激烈的措施易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性失活。此外，將某種水解酶類固定于膜上，能降解造成極化現(xiàn)象的大分子，提高流速。不過(guò)這種措施沒(méi)有通用性，只適用于一些特殊情況。 實(shí)驗(yàn)用超濾器的類型： （ 1） 無(wú)攪拌式裝