【文章內容簡介】 的洗脫峰寬度成反比。 第 8 章 離子交換 離子交換常用洗脫方法： 從樹脂上洗脫目的物的方法主要有兩種： （ 1） 調節(jié)洗脫液的 pH，使目的物粒子在此 pH 下失去電荷，甚至帶相反電荷，從 而喪失與原離子交換樹脂的結合力而被洗脫下來。 （ 2） 用高濃度的同性離子根據(jù)質量作用定律將目的物離子取代下來。 離子交換樹脂的命名法。舉兩種樹脂骨架。 樹脂命名編號：強酸類 1~100號，弱酸類 101~200號，強堿類 201~300號，弱堿類 301~400號，中強酸 401~500。各種樹脂除注明類別和編號外，還需標明載體的交聯(lián)度。書寫交聯(lián)度時，將百分號除去，寫在樹脂編號后并用乘號“ X”隔開。強酸 1X7，交聯(lián)度為 7%。 樹脂骨架：（ 1）苯乙烯型離子交換樹脂 （ 2）丙烯酸型陽離子交換樹脂 （ 3）多乙烯多胺 —— 環(huán)氧氯 丙烷樹脂 （ 4）聚乙烯砒啶系離子交換樹脂 （ 5）其他離子交換樹脂 蛇籠樹脂 選擇性離子交換樹脂 熱再生離子交換樹脂 離子交換的選擇性的因素：一、離子化合價與水合半徑的影響 二、離子化合價與離子濃度的影響 三 |、交換環(huán)境的影響 （ 1）溶液的 pH （ 2）離子強度 （ 3）有機溶劑 四、樹脂結構的影響 （ 1）樹脂載體交聯(lián)度 （ 2）輔助力 （ 3）其他結合力 五、偶極離子排斥作用。 偶極離子的交換特點：凈電荷為零時，正電中心和負電中心并不重疊，遂成偶極。 鈉型樹脂，被吸附的氨基酸的羧基所帶的負電荷與樹脂 磺酸基的負電荷產(chǎn)生排斥力。偶極離子的排斥作用，所以使樹脂對氨基酸的吸附量大大降低。 氫型樹脂：由于氨基酸的解離度低，被取代之氫離子為羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶極，故與樹脂磺酸基沒有排斥力。 偶極離子的排斥力隨氨基酸的 R基碳鏈的加長而減弱。適當增加溶液中離子強度，偶極排斥力減弱。 大孔、均孔樹脂的特點：大孔型離子交換樹脂的特征： 1 載體骨架交聯(lián)度高，有較好的化學和物理穩(wěn)定性及機械強度。 2孔徑大，不受環(huán)境條件的影響，動力學性能好，抗污染能力強，交換速度快。 3 表面積大，表面吸附能力強，對大分子物質的 交換容量大 4 孔隙率大，比重大，對小離子的體積交換量比凝膠型樹脂小。均孔樹脂的特點：主要為陰離子交換樹脂，骨架的交聯(lián)度比較均勻，孔徑大小一致，重量和體積交換容量都較高，膨脹度、相對密度適中、機械強度好、抗污染和再生能力強。 離子交換纖維素的特點及洗脫。 離子交換纖維素為開放的長鏈骨架，大分子物質能自由地在其中擴散和交換，親水性強，表面積大，易吸附大分子；交換基團稀疏，對分子的實際交換容量大；吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不易引起變性；分辨率強，能分離復雜的生物大分子混合物。 洗脫：對離子交換纖維素進行吸附 后的洗脫一般比從離子交換樹脂的洗脫緩和。升高環(huán)境的 pH 或是降低環(huán)境的 pH或增加離子強度都能將被吸附物質洗脫下來。 酸堿性蛋白選擇合適的離子交換纖維素。 酸性蛋白質（等電點約 pH5），作為一個陰離子，它的 DEAE纖維素柱層析可在 pH5。 5~9。 0之間進行，蛋白質和交換劑都是解離的，帶有相反的電荷。在 CM纖維素上層析則需限制在（ ~）之間。堿性蛋白質（等電點約 pH8）作為一個陽離子，用羧甲基纖維素層析可在 pH3.~ 進行。 離子交換聚焦色譜的原理： （ 1） pH 梯度的形成：色譜聚焦 利用離子交換劑本身的帶電基團的緩沖作用，當洗脫緩沖液不斷滴到離子交換柱上時，柱內自動形成 pH 梯度。 （ 2）蛋白質的色譜行為：蛋白質所帶電荷取決與他們的等電點和介質的 pH 低于它的等電點時，蛋白質帶正電荷，它不與陰離子交換劑結合，隨洗脫液向下移動。 （ 3）聚焦效應：當一種蛋白質在柱上隨洗脫液下移至等電點處，移動速度明顯減慢。加上相同的第二個樣品，它將以洗脫液移動的速度下降，直到追到正在慢移的第一個樣品成分處（聚焦）。然后這兩個樣品一起下移，往柱下一起洗脫出來。所有的樣品必須在第一個樣品峰尚未 被洗脫前加入。 9舉例三種常用離子交換樹脂和離子交換纖維素。 大孔型強酸型離子交換樹脂 大孔型弱酸型離子交換樹脂 大孔型弱堿型離子交換樹脂 甲基磺酸纖維素 乙基磺酸纖維素 二乙基氨基乙基纖維素 芐基化的 DEAE 纖維素 術語： CMC：羧甲基纖維素。 DEAEC：二乙氨基乙基纖維素。 PBE94：多緩沖交換劑 尼柯爾斯方程： m1(1/z1) / m2(1/z2) = K c11/z1 / c21/z2..交換容量： meq/g(毫克當量 /克樹脂 ) 樹脂再生：使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理 過程。 偶極離子排斥：被吸附的氨基酸的羧基所帶的負電荷與樹脂之負電荷產(chǎn)生排斥力。 蛇籠樹脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型陰離子交換樹脂中聚合而成的一類樹脂。 第九章 親和層析 親和層析原理，主要特點。 利用生物體中多數(shù)大分子物質具有與某些相應的分子專一型可逆結合的特性。 主要特點：經(jīng)過一此簡單的處理就可以獲得所需的高純度活性物質。對設備要求不高，操作簡便，使用范圍廣，特異性強，分離速度快，分離效果好，分離條件溫和。缺點是吸附劑的通用性較差。 選擇配基的注意點：（ 1）配基與配體由足夠大的親和力（ 2） 配基與配體的結合應是專一的（ 3）配基應具有化學活性。 手臂，其長短與親和層析的效果的聯(lián)系，為什么。 由于酶的活性中心常是埋藏在其結構的內部，它們與介質的空間障礙影響其與親和配基的結合作用。在載體和配基之間插入手臂，以消除空間障礙，手臂的長度是有限的，太短不能起消除空間障礙的作用，太長會使非特異性性吸附增加。 制作高親和力的親和吸附劑 :提高親和層析效果，固定相的配基和流動相的配基具有較強的親和力。配基濃度對親和力的影響。為了將親和配體和其他物質分開，在實際親和層析時，通常需要阻流值≥ 10?？臻g障礙的影響：插入適當長度的手臂。配基與載體的結合位點的影響。載體孔徑的大小對吸附劑的親和能力有決定性的作用。微環(huán)境的影響，包括載體及手臂的電性、極性、次級鍵對配基親和力的影響。 非專一性吸附包括那些：如何克服。 親和層析中的非專一性吸附有以下情況：（ 1）離子情況 （ 2）疏水基團 a長的烴類結構的“手臂” b疏水性配基 （ 3）復合親和力 確定離子 強度以獲得良好的分離效果 親和層析洗脫方法：（ 1）非專一性洗脫 改變洗脫劑的 pH 以影響電性基團的解離程度而洗脫（ 2）特殊洗脫 （ 3）專一性洗脫 競爭性效應 非競爭性效應 反競爭性效應 二次作用親和沉淀 :利用在物理場（如 pH、離子強度、溫度和舔加金屬離子等）改變時溶解度下降，發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基，制備親和沉淀介質。親和介質結合目的分子后，通過改變物理場使介質與目標分子共同沉淀的方法。 親和膜分離原理及特點：親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是 固定床親和層析的變型。 優(yōu)點：（ 1）傳質阻力小，達到吸附平衡的時間短，配基利用率高。 （ 20壓降小，流速快，設備體積小，配基用量低。 缺點：理論塔板很低，吸附和清洗率低。 9 術語： 親和力：配基對互補分子間的作用力，是制備高效親和柱的重要參數(shù)。親和吸附劑：載體 —— 配基。配基：在親和層析中起可逆結合的特異性物質。阻流值： Ve/Vo。正洗脫：吸附提取物中的有效成分。負洗脫：去處提取物中的雜質。金屬螯合層析：利用金屬離子的絡合或形成螯合物的能力吸附蛋白質的分離系統(tǒng)。 有機染料親和層析：有機染料如蒽醌化合物和偶氮 化合物具有類似于 NAD+的結構，一些需要核酸類物質為輔酶的酶，對這些染料具有一定的親和力，將這些染料共價偶聯(lián)到纖維素或瓊脂等多糖載體上，就制得親和層析柱。 親和錯流過濾： (affinity cross flow filtration)ACFF 將親和層析與超濾技術結合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應后，用膜進行錯流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點。 親和萃?。豪门悸?lián)親和配基的 PEG 為成相聚合物進行目標產(chǎn)物的雙水相萃取，可在親和配基的親和作用下促進目標產(chǎn)物在 PGE相（上相）的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇 性。 親和反膠團萃?。菏侵冈诜茨z團相中除通常的表面活性劑（如 AOT）外，舔加另一種親水頭部為目標分子的親和配基的助表面活性劑，通過親和配基與目標分子的親和結合作用，促進目標產(chǎn)物在反膠團相的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和反膠團萃取分離的選擇性。 第十章 離心技術 相對離心力：（ RCF）離心力與重力的比值。用符號“ g” 或 “ g” 表示。 RCF= 106? N2 r ( g) 離心機轉子有幾種，各自特點。 （ 1）角度轉子：機械強度高，重心低，運轉平穩(wěn)，壽命長，管內溫度分布均勻，溫差對流小，離心時間短，使用方便，但離心管外壁易產(chǎn)生強烈對流和渦流，同時管外側會出現(xiàn)沉淀，形成壁效應。 （ 2）水平轉子：結構復雜，加工困難，機械強度低，重心高，容量小，低速運轉時易搖擺，離心時間長，壽命短而價格高。對流作用小，“壁效應”弱。 （ 3）區(qū)帶轉子： Anderson 轉子，無離心管，“十”字隔板將樣品槽分為四個扇形室。無壁效應，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。配有附屬設備和儀器，操作過程復雜，設備較貴，但離心機使用效率 高。 （ 4）垂直管轉子：特殊類型的定角轉子。離心時的碰撞及溫差引起的對流不顯著。顆粒沉降時間短，可用于差速、密度梯度及等密度離心，用于平衡等密度離心時效果最佳。 （ 5）連續(xù)離子轉子：低速或高速離心機轉子，可用于超速離心機。結構簡單，低速時加樣，高速時排出清夜。用于實驗室，也可用于小規(guī)模生產(chǎn)，最適宜自培養(yǎng)液中收集菌體及細胞。 （ 6）細胞洗脫轉子：低速離心時連續(xù)分離型轉子，最高轉速不超過 6000r/min。最適于自動植物培養(yǎng)液或發(fā)酵液中連續(xù)分離單細胞和菌體，回收濃度及回收率均較高。 速度區(qū)帶離心的特點及其用 途：離心操作時將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線形或非線形密度梯度液上，控制離心時間，使所需組分通過部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達到其等密度區(qū)之前即停止離心。 速度區(qū)帶離心的特點：（ 1）樣品加于梯度介質的頂步、離心時間需嚴格控制。（ 2）介質的密度需嚴格掌握：梯度最大值≤組分最小密度（ 3）樣品的密度 梯度密度最小值 (4)分離依據(jù)是各組分之沉降系數(shù)差（ 5）分辨率受組分沉降系數(shù)、離心時間、顆粒擴散系數(shù)、介質黏度及梯度范圍和形狀的影響。本法適于分離顆粒大小不同而密度相近的組分，如 DNA 與 RNA 混合物、核蛋白體亞單位及線 粒體、溶酶體及過氧化酶體。 差分離心的特點、用途。 原理是依據(jù)不同大小和密度的顆粒在離心力場中沉降速度的差異進行離心分離。所得的沉淀物只具有相對純度而不具有絕對均一性。 密度梯度的設計包括：（ 1）密度梯度介質的選用（ 2）梯度的密度范圍（ 3）梯度的形狀 （ 4）梯度的容量、（ 5）直線型梯度的斜率 “密度梯度”通常的制備方法：（ 1）不連續(xù)梯度的制備、（ 2）混合梯度法（ 3）離心平衡法 梯度的取出與收集的方法：（ 1）底部穿刺法（ 2）頂步收集法 取代法 虹吸法 （ 3）切割法 凍結切割法 聚合切割法 8術語 區(qū)帶轉子： Anderson 轉子，無離心管，“十”字隔板將樣品槽分為四個扇形室。無壁效應，適用于大量樣品的密度梯度及等密度梯度離心。 角度轉子：定角轉子 速度區(qū)帶離子法：離心操作時將樣品液置于連續(xù)或不連續(xù)線形或非線形密度梯度液上，控制離心時間，使所需組分通過部分梯度液，形成的分離區(qū)帶在達到其等密度區(qū)之前即停止離心。 差分離心：差速離心。原理是依據(jù)不同大小和密度的顆粒在離心力場中沉降速度的差異進行離心分離。所得的沉淀物只具有相對純度而不具有絕對均一性。 等密度離心法：離心平衡法，在離心力的作用下，不同 密度的多組分顆粒在梯度介質中“向上”或“向下”移動。當移動至其密度與介質密度相等的位置便不再移動，形成靜止區(qū)帶，即達到離心平衡。 第十一章 過濾和膜分離技術 用于制作透析膜的材料所應具有的特點： （ 1） 在使用的溶劑介質中能形成具有一定孔徑的分子篩樣薄膜。由于介質一般為水，所以膜材料應具有親水性，它只允許小分子溶質通過。 （ 2） 在化學上呈惰性。 不具有與溶質、溶劑起作用的基團。 （ 3） 有良好的物理性能。包括一定的強度和柔韌度，不易破裂，有良好的再生性能，便于多次重復使用。 透析裝置的類型：（ 1）旋轉透析器 （ 2）平面透析器 （ 3）連續(xù)透析器 （ 4）淺流透析器 克服濃差極化現(xiàn)象的措施： 克服極化的主要措施有振動、攪拌、錯流、切流等技術，但應注意過于激烈的措施易使蛋白質等生物大分子變性失活。此外，將某種水解酶類固定于膜上，能降解造成極化現(xiàn)象的大分子，提高流速。不過這種措施沒有通用性，只適用于一些特殊情況。 實驗用超濾器的類型： （ 1） 無攪拌式裝