【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 0。+HI7）酚羥基的化學(xué)修飾來(lái)源： Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）8）吲哚基的化學(xué)修飾 來(lái)源： Trp 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N溴代琥珀酰亞胺氨基酸 側(cè)鏈基團(tuán) 修飾劑Lys 氨基 三硝基苯磺酸， 2， 4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、 Glu 羧基 水溶性碳化二亞胺Arg 胍基 苯乙二醛， 1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys 巰基 碘乙酸、碘乙酰胺、 N乙基馬來(lái)酰亞胺二硫鍵 巰基乙醇、 DTTHis 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr 酚羥基 碘、四硝基甲烷Trp 吲哚基 N溴代琥珀酰亞胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑 但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋孩?任何一種修飾劑不是絕對(duì)專一的。② 有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化 —— 失活， 不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。③ 不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。(4) 酶蛋白主鏈修飾 (肽鏈有限水解修飾 )o 利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。o 酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切 /酶原激活法。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。主鏈切斷修飾應(yīng)用實(shí)例：1）提高酶活力：2）消除抗原性：主鏈連接修飾o 將兩種或兩種以上的酶通過(guò)主鏈連接在一起，形成一個(gè)酶分子具有兩種或多種催化活性。－－－－多酶融合體肽鏈上含有 2種或 2種以上催化活性的酶，往往是基因融合的產(chǎn)物。它可以是單體酶，也可以是寡聚酶或更復(fù)雜的多酶體系。例如 E． coli天冬氨酸激酶 I高絲氨酸脫氫酶 I融合體，在天冬氨酸到絲氨酸生物合成中催化兩步反應(yīng)，該酶是 α4 四聚體，每條肽鏈含有兩個(gè)活性： N端部分的天冬氨酸激酶和 C端部分的高絲氨酸脫氫酶，所以又稱雙頭酶；來(lái)自樟樹(shù)種子的克木毒蛋白由一條肽鏈組成，具有 3種不同的酶活性；紅色鏈孢霉的 AROM多酶融合體是一個(gè)二聚體，每條肽鏈含 5種酶活性。a、胃蛋白酶原的激活 b、胰蛋白酶原（ trypsinogen）的激活 c、胰凝乳蛋白酶原（ chymotrypsinogen）的激活 o 氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。 o 現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是 定點(diǎn)突變技術(shù) 。定點(diǎn)突變（site directed mutagenesis）是 20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。是指在 DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ Protein Engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。(5) 氨基酸置換修飾酶分子的定點(diǎn)突變基因序列分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析酶活性中心分析引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變酶基因克隆表達(dá)變異特性分析(6) 酶分子的物理修飾 o 通過(guò)物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端 pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。o 特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排?；乇菊履夸?酶修飾后的性質(zhì)變化o 熱穩(wěn)定性 ：一般來(lái)說(shuō)，熱穩(wěn)定性有較大的提高。 o 抗原性 ：比較公認(rèn)的是 PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。o 各類失活因子的抵抗力 ：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。o 半衰期 ：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期。o 最適 pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適 pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適 pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。 o Km的變化 ：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后， Vm沒(méi)有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后， Km值變大?；乇菊履夸浢傅鞍踪|(zhì)工程的目標(biāo)o 功能改變 減小 Km， Vmax， pH改變，去除抑制部位，改變專一性o 結(jié)構(gòu)特性 穩(wěn)定性o 新體系構(gòu)建 雜合酶和多功能酶，添加便于分離的片斷 化學(xué)修飾方法的局限性：隨著 M上升，擴(kuò)散速度受限；蛋白表面被部分屏蔽，生物活性降低修飾劑呈現(xiàn)多聚合度，選擇性不夠高蛋白質(zhì)工程的主要手段o 基因突變定點(diǎn)突變；隨機(jī)突變o 基因剪接基因缺失；基因融合 酶的定向進(jìn)化o 酶分子的 合理設(shè)計(jì) (rational design)o 酶分子的 定向進(jìn)化 (directed evolution)酶的合理設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程改造的實(shí)際應(yīng)用 1）增強(qiáng)抗氧化性 2）改變底物特異性枯草桿菌蛋白酶 是重要的工業(yè)用酶 ,但該酶很容易被氧化 ,氧化后的蛋白酶很快地失去活性 . ?絲氨酸蛋白酶， 275aa?用途：洗衣粉?缺點(diǎn)：表面劑對(duì)其結(jié)構(gòu)破壞，漂白劑化學(xué)氧化失活?活性位點(diǎn)： 221的 Sero 222位是易被氧化的 Met,也是酶的活性中心 .將Met222突變?yōu)?Ala,得到了抗氧化能力較強(qiáng)并保留較高活性的突變?；钚?53％；o Ser236位于橫貫枯草蛋白酶 E的 α螺旋末端，遠(yuǎn)離催化活性中心，引入 Ser236Cys,可能會(huì)形成分子間二硫鍵，有利于提高酶的穩(wěn)定性。Ser236Cys變體酶 (BP1)活性是野生型蛋白酶 E的 1． 5倍，熱穩(wěn)定性提高 3倍；o 枯草桿菌蛋白酶的第 99位門冬氨酸及 156位谷氨酸替換為賴氨酸后，使這個(gè)酶在 pH7時(shí)的活力提高了1倍，在 pH6時(shí)活力提高了 10倍。（ Lysozyme） 1)抗菌范圍的擴(kuò)大 2)熱穩(wěn)定性的提高T4溶菌酶的第 51位蘇氨酸轉(zhuǎn)變成脯氨酸 ,使該酶對(duì) ATP的親和力增強(qiáng) ,酶活力提高了 25倍 . 3：胰蛋白酶Arg117位自熔點(diǎn)缺失突變 —— 穩(wěn)定性提高將酶分子表面正電荷改變成負(fù)電荷 —— 對(duì)精氨酸專一性提高4 木糖異構(gòu)酶o 特點(diǎn)：四聚體， 45000，金屬離子輔助因子o 缺點(diǎn)：熱失活降低固定化壽命o 原因：兩個(gè)二聚體相對(duì)欠穩(wěn)定，幾個(gè) lys高糖下易糖化； gly中斷穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)o 改造： Gly70S。Gly74T。Ala73S— 半衰期93上升 114h 1993年 ,美國(guó)科學(xué)家 Arnold F H首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念，并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出體外定向進(jìn)化的意義體外定向進(jìn)化的意義o 理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開(kāi)發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。o 所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過(guò)人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制 (隨機(jī)突變、重組和自然選擇 )，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。o 酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問(wèn)題，為