【正文】 換修飾酶分子的定點突變基因序列分析蛋白質結構分析酶活性中心分析引物設計進行基因定點突變酶基因克隆表達變異特性分析(6) 酶分子的物理修飾 o 通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端 pH值等）由于酶分子空間構象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。o 各類失活因子的抵抗力 ：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。修飾酶最適 pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應用上有較大意義。Ser236Cys變體酶 (BP1)活性是野生型蛋白酶 E的 1． 5倍，熱穩(wěn)定性提高 3倍；o 枯草桿菌蛋白酶的第 99位門冬氨酸及 156位谷氨酸替換為賴氨酸后，使這個酶在 pH7時的活力提高了1倍，在 pH6時活力提高了 10倍。蛋白質定向進化概念的提出體外定向進化的意義體外定向進化的意義o 理論上，蛋白質分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。定向進化技術定向進化的原理定向進化的原理定向進化的原理o 在待進化酶基因的 PCR擴增反應中，利用 Taq DNA聚合酶不具有 3’5’ 校對功能的性質，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質的優(yōu)化酶 (或蛋白質 )，從而排除其他突變體。 易錯 PCR技術 (errorprone于 1994 交錯延伸技術 (StEP)：由 Zhaoshuffling216。 DNA改組 (DNA shuffling)又稱有性 PCR (sexual PCR)，原理如圖所示。所謂隨機引物是含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，它可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應引物的作用。通常 ,篩選方法必須靈敏篩選方法必須靈敏 ,至少與目的性質相關至少與目的性質相關 。n 單一碳源的選擇性培養(yǎng)基，使能夠利用反應底物的微生物獲得生長優(yōu)勢而大量增殖，無法利用反應底物的微生物由于無法獲得營養(yǎng)生長受到抑制，從而得到所需的目的菌株。酶的高通量篩選基于比色法和熒光檢測的高通量篩選 基于檢測培養(yǎng)基篩選法的， 生色基團或熒光基團的底物參加的催化反應是最容易實現高通量篩選的。l 基于這種技術的檢測方法簡單快捷，結果準確容易實現數字化，可以做到實時監(jiān)控，得到了廣泛的應用。這一技術最近被用于熒光假單胞菌酯酶定向進化中突變體的篩選，得到了立體選擇性明顯提高的突變體Quick E 示意圖基于反應熱力學變化紅外檢測的高通量篩選o 所有的物質都可以發(fā)射紅外線，光電平面聚焦陣列紅外檢測器可以靈敏地檢測反應過程中的熱量變化（檢測波長范圍 35μm ，溫度變化 10100mK）。 l 隨著生物催化在精細化工和醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應用，對手性純化合物的大量需求使手性酶的篩選成了當前的研究熱點，同時產品價值的提高也將使得很多借助復雜儀器設備的高成本的檢測方法成為可能并將逐漸得到更多的應用。 定向進化的實質是達爾文進化論在分子水平上的延伸和應用。 兩者的不同：?進化動力不同： 保守突變 非保守取代；?進化方向不同： 適應突變的積累； ?進化速度不同： 非常漫長 只需幾年、甚至幾天； ? 進化目標不同： 適應環(huán)境 超越生物學意義的要 求，探索所希望的蛋白質在順序空間的可及性。 二硫鍵 （ disulfide bond） —— 由兩個 Cys的側鏈 SH氧化而成，是某些蛋白質維持結構穩(wěn)定性的主要因素。對酶分子穩(wěn)定性有關的鹽鍵大部分形成于分子表面上。途徑 方法 優(yōu)點 不足酶分子改造核酸水平 蛋白質工程 從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復雜，周期長蛋白質水平 化學修飾 適應所有酶，操作簡單經濟修飾過程破壞酶分子劑型 固定化 適應所有酶，穩(wěn)定性高，可重復利用和連續(xù)生產載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體 穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良 穩(wěn)定劑 簡單、經濟 工作量大反應介質 適用于特殊反應體系和酶類適合的酶類還不普遍2. 穩(wěn)定酶的方法附 2：酶的活性中心（ active site） 一、活性中心的概念v酶的必需基團酶的必需基團 (essential group): 與酶活性有關的基團與酶活性有關的基團v酶的活性中心酶的活性中心 (active center): 由必需基團構成的與酶催化活性有關的特定區(qū)域由必需基團構成的與酶催化活性有關的特定區(qū)域 . 酶分子非必需基團必需基團活性中心必需基團活性中心外必需基團結合基團催化基團非活性中心活性中心活性中心的重要化學基團 7種氨基酸出現的頻率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （蘭天果拌豬肉絲） 某些功能基團 ,如（氨基、羧基、巰基、羥基 和咪唑基）是酶的必需基團。 (4)活性中心構象不是固定不變的（誘導契合）。若某基團被修飾后： 酶活性不變 —— 該基團可能不是酶的必需基團酶活性降低或喪失 —— 該基團可能是酶的必需基團但不能確定化學試劑是同活性中心內的必需基團結合 ?；瘜W修飾含同位素標記 的同樣試劑2)專一性化學修飾（基團專一性修飾） 用專一性化學修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側鏈基團。② 具有活潑的化學基團 （如鹵素）可與活性 中心的基團形成穩(wěn)定的共價鍵。作用機制： 利用酶對底物的特殊親和力將酶加以修飾標記。② S或可逆抑制劑有保護作用（活性中心）。Active siteThe active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzymesubstrate plex, and transforms it into product. The active site is a threedimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.三、研究酶活性中心的方法 ： 用 X射線衍射法直接檢測底物或其類似物與酶形成的中間復合物（包括酶和底物）的相對位置。(2)活性部位是一個三維實體。分子間形成的范德華力越大越穩(wěn)定。氫鍵 （ hydrogen bond）： 是穩(wěn)定蛋白質分子的空間結構，特別是二級結構的重要力量。 我們相信，隨著 基因工程技術 、 蛋白質工程技術 以及 高通量篩選技術 的迅速發(fā)展，定向進化技術將成為獲得新酶的一個有效快捷的手段，這將為工業(yè)生產提供更多性能優(yōu)良的酶制劑。 定向進化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進化，使進化朝著人們需要的方向發(fā)展。 盒式誘變對硝基苯酯酶 底物專一性 /有機相活性 易錯 PCR/DNA改組 l 采用放射性同位素標記底物進行脂酶的篩選取得了較好的實驗結果，這種方法靈敏而且準確，但由于放射性其使用會受到限制無法推廣使用。167。基于比