【正文】 確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合 。途徑 方法 優(yōu)點(diǎn) 不足酶分子改造核酸水平 蛋白質(zhì)工程 從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)蛋白質(zhì)水平 化學(xué)修飾 適應(yīng)所有酶，操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)修飾過(guò)程破壞酶分子劑型 固定化 適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體 穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良 穩(wěn)定劑 簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì) 工作量大反應(yīng)介質(zhì) 適用于特殊反應(yīng)體系和酶類(lèi)適合的酶類(lèi)還不普遍2. 穩(wěn)定酶的方法附 2：酶的活性中心（ active site） 一、活性中心的概念v酶的必需基團(tuán)酶的必需基團(tuán) (essential group): 與酶活性有關(guān)的基團(tuán)與酶活性有關(guān)的基團(tuán)v酶的活性中心酶的活性中心 (active center): 由必需基團(tuán)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域由必需基團(tuán)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域 . 酶分子非必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性中心必需基團(tuán)活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)非活性中心活性中心活性中心的重要化學(xué)基團(tuán) 7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （蘭天果拌豬肉絲） 某些功能基團(tuán) ,如（氨基、羧基、巰基、羥基 和咪唑基）是酶的必需基團(tuán)。 二硫鍵 （ disulfide bond） —— 由兩個(gè) Cys的側(cè)鏈 SH氧化而成，是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素。 定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。 l 基于這種技術(shù)的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，結(jié)果準(zhǔn)確容易實(shí)現(xiàn)數(shù)字化，可以做到實(shí)時(shí)監(jiān)控，得到了廣泛的應(yīng)用。n 單一碳源的選擇性培養(yǎng)基，使能夠利用反應(yīng)底物的微生物獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)而大量增殖，無(wú)法利用反應(yīng)底物的微生物由于無(wú)法獲得營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)受到抑制，從而得到所需的目的菌株。所謂隨機(jī)引物是含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，它可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)引物的作用。216。 交錯(cuò)延伸技術(shù) (StEP)：由 Zhao于 1994定向進(jìn)化技術(shù)定向進(jìn)化的原理定向進(jìn)化的原理定向進(jìn)化的原理o 在待進(jìn)化酶基因的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用 Taq DNA聚合酶不具有 3’5’ 校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫(kù)，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶 (或蛋白質(zhì) )，從而排除其他突變體。Ser236Cys變體酶 (BP1)活性是野生型蛋白酶 E的 1． 5倍，熱穩(wěn)定性提高 3倍；o 枯草桿菌蛋白酶的第 99位門(mén)冬氨酸及 156位谷氨酸替換為賴(lài)氨酸后，使這個(gè)酶在 pH7時(shí)的活力提高了1倍，在 pH6時(shí)活力提高了 10倍。o 各類(lèi)失活因子的抵抗力 ：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。定點(diǎn)突變（site directed mutagenesis）是 20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱(chēng)肽鏈有限水解。HI7）酚羥基的化學(xué)修飾來(lái)源： Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）8）吲哚基的化學(xué)修飾 來(lái)源： Trp 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N溴代琥珀酰亞胺氨基酸 側(cè)鏈基團(tuán) 修飾劑Lys 氨基 三硝基苯磺酸， 2， 4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、 Glu 羧基 水溶性碳化二亞胺Arg 胍基 苯乙二醛， 1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys 巰基 碘乙酸、碘乙酰胺、 N乙基馬來(lái)酰亞胺二硫鍵 巰基乙醇、 DTTHis 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr 酚羥基 碘、四硝基甲烷T(mén)rp 吲哚基 N溴代琥珀酰亞胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑 但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋孩?任何一種修飾劑不是絕對(duì)專(zhuān)一的。Performic修飾劑： 丁二酮 二羰基化合物 1， 2－環(huán)己二酮 苯乙二醛4)巰基的化學(xué)修飾 來(lái)源： Cys 修飾反應(yīng) :烷基化 修飾劑：碘乙酸 (IAA) 碘乙酰胺 (IAM) ? 硝化：?連四硫酸鹽氧化巰基， DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。?幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)?；磻?yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)1. 化學(xué)修飾反應(yīng)的類(lèi)型 1) 烷基化反應(yīng)o 試劑特點(diǎn)： 烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－ NH2， SH等）發(fā)生烷基化。（ 1）蛋白類(lèi)酶主要由蛋白質(zhì)組成，酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。 o 分離 ：需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。非共價(jià)修飾采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法o 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過(guò) 共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。p 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來(lái)含有金屬離子的酶。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。酶分子修飾的條件o 修飾反應(yīng)盡可能在 酶穩(wěn)定條件 下進(jìn)行，并盡量 不破壞酶活性功能的必需基團(tuán) ，使 修飾率高 ，同時(shí)酶的 活力回收高 。 酶分子修飾的基本要求和條件 o 對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。酶分子修飾的意義o 提高酶的 活力 activityo 增強(qiáng)酶的 穩(wěn)定性 stabilityo 降低或消除酶的 抗原性 immunological propertyo 研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響 structure 一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule酶的分子修飾Contents of chapter 4什么是酶分子修飾酶分子修飾的基本要求和條件酶分子的修飾方法酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo酶的定向進(jìn)化附：酶的活性中心Go 什么是酶分子修飾？o 通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱(chēng)為酶分子修飾。 2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。 破壞了抗原決定簇 —— 抗原性降低乃至消除 “ 遮蓋 ” 了抗原決定簇 —— 阻礙抗原、抗體結(jié)合2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成 “ 緩沖外殼 ” ，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。n （ 3） 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等。 α 淀粉酶中的鈣離子（ Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子 (Zn2+)，過(guò)氧化氫酶分子中的鐵離子 (Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（ Zn2+） ,超