酶的分離和純化ppt課件(存儲(chǔ)版)
【正文】 ? ↓ ? 加熱 90100℃ （ 水浴加熱 ） ? b） 層析柱準(zhǔn)備： 100柱； 稠膠灌柱； 23個(gè)床體積的緩沖液平衡； 流速 1618ml/h ? c） 層析：蘭葡聚糖 （ 分子量 2 106） 驗(yàn)柱并求外水體積 （ V0） ；上樣量 15% ； ? 恒壓洗脫； 流速 1618ml/h ? d） 凝膠后處理： NaOH+ NaCl處理后 4℃保存 ? 長(zhǎng)時(shí)間不用可采用乙醇脫水保存或低溫干燥保存 凝膠過(guò)濾層析原理圖 Gel filtration chromatography 5） 親和層析 （ affinity chromatography） 特異性結(jié)合 ? a） 關(guān)鍵：配體；配體與支持物的連接方法；吸附 、 洗脫條件 ? b） 支持物的選擇：非特異性吸附作用低；液體流動(dòng)性好；較寬的 pH、 離子強(qiáng)度；豐富的化學(xué)基團(tuán)；有效的多孔性 常用瓊脂糖 、 聚丙烯酰胺凝膠和受控多孔玻璃球 ? c） 配體的選擇：有親和力但不易過(guò)大 ? d） 配體與支持物的連接：載體結(jié)合法；物理吸附法；交聯(lián)法；包埋法 （ 先活化支持物上的功能基團(tuán)再將配體連上去 ） ? e） 吸附劑的衍生物：支持物 +空間臂 ? f） 層析條件的選擇：蛋白質(zhì) +配體 → 蛋白質(zhì) 配體復(fù)合物 起初配體濃度恒定 ， 隨蛋白濃度增加平衡右移 （ 逐漸保留特性 ） ，故親和力較低也能成功的親和 。 為了測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量 ， 分別取幾個(gè)不同的蛋白質(zhì)濃度 c， 測(cè)出對(duì)應(yīng)的滲透壓 π， 然后以 π/c對(duì) c作圖 ， 并作延長(zhǎng)線外推至 c=0， 得到的 y軸截距即為 limπ/c的值 ， 代入上式可求得分子量 M。 經(jīng)過(guò)一系列純化步驟以后得到的 4mL酶制品 （ 含有 白 ） ， 總活力為 288單位 。 ? 酶活力：檢測(cè)目的酶的活力 ? 目的蛋白 （ 非酶 ） 檢測(cè)較困難 第一次比活力每次比活力 純化倍數(shù) = 回收率 % = 100 第一次總活力每次總活力 酶的提純過(guò)程記錄格式 步驟 總體積（ ml） 蛋白總量（ mg） 總活力（ u） 比活力（ u/mg） 回收率 （ %） 提純 倍數(shù) 粗抽提液 50℃ 熱變性除雜 硫銨分級(jí)沉淀（30%50%） DEAE纖維
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