【正文】 〔dialysis〕和超過濾〔ultrafiltration〕 2：密度梯度〔區(qū)帶〕離心 3：凝膠過濾法,第四十二頁，共一百一十三頁。)沉淀。u xi224。,第四十六頁，共一百一十三頁。,第四十七頁，共一百一十三頁。)別離蛋白質(zhì),0~40oC之間：大局部球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加， 例外：0～25oC，人的血紅蛋白溶解度隨溫度上升(sh224。ndi224。,電泳的方向與速度與以下因素有關(guān)(yǒuguān)： ①電荷的正負性 ②電荷的多少 ③顆粒的大小與形狀。,電泳(di224。)原理分類,第五十四頁，共一百一十三頁。r)產(chǎn)生折射率梯度，利用適當?shù)墓鈱W系統(tǒng)〔見沉降速度法〕可以觀察到界面的移動。n yǒnɡ),它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板〔不連續(xù)(li225。 分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，有更高的分辨率。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(zhuāngzh236。ng)蛋白質(zhì)就別離開了,第六十四頁，共一百一十三頁。,3.等電聚焦(j249。,等電聚焦可以把人的血清分成40多個條帶。,等電聚焦(j249。)起來的電泳技術(shù)。,是根據(jù)(gēnj249。n)層析(P310),第七十三頁，共一百一十三頁。)到層析柱上的蛋白質(zhì)的洗脫有不同的洗脫方式：,第七十五頁，共一百一十三頁。n hu224。itǐ)外表。n hu224。ng)最低相對分子質(zhì)量,用化學分析方法測定出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量,可以(kěyǐ)計算出蛋白質(zhì)的最低相對分子質(zhì)量。nt242。nɡ y232。s224。,第九十二頁，共一百一十三頁。i)離心場的沉降速度。,大局部生物大分子的沉降系數(shù)介于11013到2001013秒的范圍。ng)平衡法測定相對分子質(zhì)量,利用較低轉(zhuǎn)速〔8000~20000 r/min〕進行(j236。ng)相對分子質(zhì)量,洗脫過程,第九十九頁，共一百一十三頁。,Gel filtration column,第一百零一頁，共一百一十三頁。,(六) SDS －PAGE法測定相對(xiāngdu236。,第一百零七頁，共一百一十三頁。zh242。)鑒定,1.電泳分析法：純的蛋白質(zhì)電泳只呈現(xiàn)(ch233。,蛋白質(zhì)等電點 等離子點 鹽析 鹽溶 蛋白質(zhì)的變性 復性 茚三酮反響 雙縮脲反響 層析 離子交換層析 凝膠過濾層析 親和層析 透析 電泳 SDSPAGE 等電聚焦(j249。(2) 細胞破碎：選擇適當?shù)姆椒?將組織和細胞破碎。蛋白質(zhì)分子量測定的主要方法,第一百一十三頁，共一百一十三頁。ng)總結(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及別離純化。,5.N末端分析：N末端殘基只可能有一種氨基酸。,二、 蛋白質(zhì)純度(chng)測定,凱氏定氮法：是經(jīng)典的標準方法,但現(xiàn)在在生物學上已不多用。oy236。ngpǐn)亦可，只要找出活性峰位置〔Ve〕即可。ng)的蛋白質(zhì),那么不能用此方法測定Mr。,利用凝膠過濾可以把蛋白質(zhì)混合物按分子(fēnzǐ)的大小別離開來,〔五〕凝膠過濾法測定(c232。,2. 沉降(ch233。沉降系數(shù)的標準(biāozhǔn)條件定為20?C,溶劑為水。,第九十三頁，共一百一十三頁。,擴散系數(shù)D：在數(shù)值上等于(děngy,第九十一頁，共一百一十三頁。)的濃度。nzǐ)的數(shù)目〕,第八十九頁，共一百一十三頁。,一、根據(jù)化學組成測定(c232。,第八十五頁，共一百一十三頁。)生物學親和力的純化方法(P313),第七十九頁，共一百一十三頁。,典型(diǎnx237。,結(jié)合(ji233。,6.離子交換(l237。 所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點不同的蛋白質(zhì)以及等電點相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。,4.蛋白質(zhì)的雙向電泳〔twodimensional electrophoresis〕,將等電聚焦電泳與SDSPAGE結(jié)合(ji233。ng)下在凝膠內(nèi)沿電場方向制造一個pH梯度。ngch233。用樣量5～30μl 1mg/ml溶液。n yǒnɡ)結(jié)果,每條帶代表不同分子量的蛋白質(zhì)或者肽段，這樣(zh232。ng)為巰基乙醇〕先對待別離的蛋白質(zhì)樣品進行預處理〔加熱煮沸3－5分鐘〕。jiē)測定。,醋酸纖維薄膜電泳等,第五十七頁，共一百一十三頁。u)電泳或稱為移動界面電泳的根底上開展起來的,如圖：先在U型管內(nèi)使蛋白質(zhì)溶液和緩沖溶液之間形成清晰的界面，然后加一外電場。從外表看與區(qū)帶電泳相似，但原理不同。 因此根據(jù)這一原理就可以從蛋白質(zhì)混合液中將各種蛋白質(zhì)別離開來，所以電泳技術(shù)已成為分析、別離蛋白質(zhì)的重要手段之一。nxi224。,〔二〕根據(jù)(gēnj249。,第四十八頁，共一百一十三頁。,鹽析法是別離(fēnl237。zǐ)后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強，因而溶解度增高。n)和PH值控制,由于不同的蛋白質(zhì)等電點不同，因此可以(kěyǐ)通過控制溶液的PH值來沉淀混合物中的某種蛋白成分。n)和PH值控制,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的PH條件下，蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)和數(shù)量會發(fā)生變化，當pH = pI，凈電荷為零，相鄰蛋白質(zhì)分子之間失去了靜電斥力而趨向于聚集(j249。,第四十一頁，共一百一十三頁。,第三十九頁，共一百一十三頁。,第三十八頁，共一百一十三頁。nɡ)的介質(zhì)是裝在凝膠柱里的凝膠珠〔或稱凝膠顆粒、凝膠球〕。xīn),?參加(jiār249。)小的顆粒沉降得快,并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度(m236。,第三十三頁，共一百一十三頁。 通過(tōnggu242。 由于透析袋內(nèi)溶液濃度高而袋外濃度低，因此，透析袋內(nèi)外將進行物質(zhì)交換(jiāohu224。)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)不同對蛋白質(zhì)進行別離。重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。nɡ xī)等。)提取。,第二十二頁，共一百一十三頁。 c.油料(y243。ng)的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中純化出來。,為什么要別離(fēnl237。雙縮脲反響可以用來檢測蛋白質(zhì)的水解程度。nx236。,第十三頁，共一百一十三頁。 suān), 磺基水楊酸〔sulfosalicylic acid〕和硝酸等.,第十二頁，共一百一十三頁。)與重金屬離子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。當除去鹽后,蛋白質(zhì)又可溶解。diǎn)大小、電荷和水化作用有關(guān),那么任何影響這些條件的因素都會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。ng)以及不能通過半透膜。,沒有其他鹽類干擾(gānrǎo)時, 蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH稱為等離子點。 蛋白質(zhì)也是一類兩性電解質(zhì),能和酸或堿發(fā)生作用。)性質(zhì),一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)(x236。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及別離(fēnl237。,第一節(jié) 蛋白質(zhì)的