【正文】 5’ 32P OH 3’ 3’HO P 5’ 3’ HO 32P 5’ I II 5’ P OH3’ 5’HO OH3’ 5’ P OH 3’ 3’HO P 5’ 3’HO OH5’ 3’HO P 5’ 磷酸酶 (I)與磷酸激酶 (II)活性 磷酸激酶的交換反應(yīng) 三 . T4 多聚核苷酸激酶 1. 催化反應(yīng)類(lèi)型 1) 激酶活性（ 5’磷酸化酶）：可將 ATP中的 γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到 ssDNA， dsDNA和 RNA分子的 5’羥基端，在這反應(yīng)過(guò)程中可有兩種方式進(jìn)行（ ） ⅰ .轉(zhuǎn)移反應(yīng)； ⅱ .交換反應(yīng) 2) 3’磷酸酶活性（ pH 56） 2. 用途 1) 5’端末端標(biāo)記 2) 分子克隆過(guò)程中以獲得 5’磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng) 四 . 末端轉(zhuǎn)移酶（ TdT） 1. 反應(yīng)特點(diǎn) 底物： dNTP及衍生物， 3個(gè)核苷酸，要求 3’OH端，需要 ssDNA作為引物，以 3’突起端的 dsDNA 為最高，亦可用于 dsDNA加尾 2. 核苷酸摻入速度 二甲基砷酸鹽緩沖液和 Mg2+可提高嘌呤核苷酸的摻入速度，而 Ca2+可提高嘧啶摻入速度 3. 用途 3’加尾，便于兩 DNA分子重組 。 6. 一研究生要將一質(zhì)粒（ pI）上的 BamHIHindIII片段取代另一質(zhì)粒（ pII）上的 BamHIXbaI片段，所獲重組質(zhì)粒（ pIII）上的插入片段要求能用 BamHIHindIII進(jìn)行回收，問(wèn)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？ 10bp 500bp HindIII EcoRI H Xb H 5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 現(xiàn)有一重組質(zhì)粒的限制酶譜和克隆到的基因轉(zhuǎn)錄方向入圖所示： 已知 HindIII克隆片段中的 BamHI（ 3kb）片段含有一完整的基因編碼區(qū)，現(xiàn)要將此 3kb的 BamHI片段克隆到另一表達(dá)載體 pB的BamHI位點(diǎn)，如何才能使插入片段與表達(dá)載體中的基因處于相同的閱讀框架？如何證明插入基因的轉(zhuǎn)錄方向是相同的？ HindIII PstI BamHI PstI BamHI BamHI HindIII pA 8kb pB 8. 為了檢測(cè)綠豆核酸酶對(duì) 5’端突起的單鏈 DNA切割是否準(zhǔn)確有效，即該酶只除去單鏈而不損傷雙鏈區(qū)。 HindIII EcoRI EcoRI EcoRI BamHI BamHI 位點(diǎn)消除 總長(zhǎng)為 9kb Tcr 。 9. 某研究者計(jì)劃將具有限制酶 BamHI粘性末端結(jié)構(gòu)的一段低聚核苷酸分子插入到一載體的克隆位點(diǎn)區(qū)。 2. 另一 DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點(diǎn)標(biāo)在DNA分子上。 限制酶與其它酶共同作用結(jié)果 。 3) 用途 a. cDNA合成用于文庫(kù)建立 。 C, 高鹽 3 二 . T4 DNA聚合酶 1. 特點(diǎn)： 5’→3 ’聚合酶活性， 1500 nt/min, 為 pol I的兩倍 3’→5’ 外切酶活性，可作用于 ssDNA和 dsDNA, 其切除速度分別為 40和 4000nt/min 2. 用途： 制備高比活性探針 (1010 cpm/μgDNA)。 C, 低鹽 47 切口 /缺口胸腺 DNA 37176。 1. RNase A分離自牛胰臟，對(duì)熱穩(wěn)定，抗去污劑（ 100℃ 加熱 15min仍具活性） , 用于除去 DNA樣品中的 RNA分子 2. 核酸酶 S7， 亦稱(chēng)微球菌核酸酶，對(duì) RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源 mRNA 十 . RNase H 作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫(kù)建立時(shí)除去 DNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。 539。 539。HO OH339。 繪制限制酶譜 。 ExoIII 用于 DNA 標(biāo)記 二 . λ外切酶 1. 反應(yīng)特點(diǎn) 1) 作用底物 : 要求 5’PO4基 。 339。 RNaseH ExoIII的外切酶和 RNaseH的作用 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b c ExoIII用于順序缺失 ExoIII ExoIII [α 32P] [α 32P] dCTP dCTP 539。 339。 P539。 OH339。HO 339。HO 339。P 539。 一 . 外切酶 III（ ExoIII） 1. 一般特點(diǎn)： 來(lái)自于 ，分子量 28,000 kD 2. 催化反應(yīng)類(lèi)型 1) 外切酶活性： 3’ 5’，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 dsDNA， pH 2) 核酸酶 H活性：除去 DNARNA雜交分子中的RNA分子， pH 3) 3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應(yīng)， pH 4) 內(nèi)切酶活性：在無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶處將 DNA鍵切開(kāi)， pH 3. 外切酶活性特點(diǎn) 1) 反應(yīng)底物：互補(bǔ) dsDNA 2) 堿基釋放速度： CATG 3) 反應(yīng)產(chǎn)物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的 dsDNA，過(guò)度反應(yīng)將導(dǎo)致 DNA降解 4. 用途 1) 核酸（ DNA）標(biāo)記 2) 基因突變 缺失 3) DNA序列測(cè)定時(shí)作順序缺失 5. 使用注意事項(xiàng) 1) 正式使用前，測(cè)定在一定條件下酶的反應(yīng)速度 2) 在一定條件下， ExoIII不能作用 GC富集區(qū) (來(lái)自于 cDNA加尾 ) 539。 CH3 CH3 CH3 RE RE RE RE RE RE RE RE RE RE RE CH3 CH3 CH3 與載體相連 甲基 化酶 人工 接頭 RE 用于基因組文庫(kù)的建立 用于 cDNA的連接 RE RE RE 第三節(jié) 核 酸 酶 dsDNA結(jié)構(gòu) : 切口 , 缺口 , 斷口 缺口 (gap) 切口 (nick) 斷口 (cut) 339。 4. E． coli中依賴(lài)于甲基化的限制修飾系統(tǒng)mrr（ mA/A）、 mcr(Am5CG)、 merB（ Pum5C） 二 . 甲基化酶活性對(duì)限制酶活性的影響 1. dcm 和 dam甲基化酶對(duì)限制酶的影響 1）抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識(shí)別順序是完全重疊還是邊界重疊 如：完全重疊 BclI— dam(GATC)； ScrFI— dcm(CCA/TGG) 邊界重疊 ClaIdam； Sau96Idcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管兩者的識(shí)別順序?yàn)楹畏N重疊 如： damBamHI， Sau3AI， BglII， PvuI； dcmBstNI 表 2 對(duì)甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶 限制酶 識(shí)別序列 * 甲基化酶 AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm BclⅠ TGATCA dam ClaⅠ GATCGAT dam EcoRⅡ CC(A/T)GG dcm HphⅠ GGTGATC dam MboⅠ GATC dam NruⅠ GATCGCGA dam Sau96Ⅰ GGNCC(A/T)GG dcm SauFⅠ CC(A/T)GG dcm StuⅠ AGGCCTGG dcm TagⅠ GATCGA dam XbaⅠ TCTAGATC dam *下橫線(xiàn)字母表示限制酶識(shí)別序列 , 綠色字母表示 dam甲基化酶識(shí)別序列 ,紅色字母表示 dcm甲基化酶識(shí)別序列 2. II型甲基化酶對(duì)限制酶活性的影響 １） 抑制同種限制酶的活性 GGATmCC— BamHI(G?GATCC) GAmATTC— EcoRI(G?AATTC) ２） 抑制不同種限制酶的活性 a. 順序完全重疊 如： M. ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ T