【文章內(nèi)容簡介】 1) 基因突變 缺失，常與外切酶，如 ExoIII、 λ外切酶、Bal31連用 2) DNA定序分析 3) S1作圖法 4) 基因結(jié)構(gòu)分析 5) tRNA結(jié)構(gòu)分析 4. 使用注意事項 1) 避免長時間反應(yīng) ， 因最適酸性 pH將導(dǎo)致 DNA斷裂或降解 2) 避免使用高濃度酶量 ， 以免 DNA被降解 (因產(chǎn)生切口 ) ExoIII S1 S1 S1 S1 S1 S1 Poly(A) Poly(A) 539。 539。 539。 539。 539。 539。 核酸酶 S1活性 五 . 綠豆核酸酶 1. 與 S1酶相同點： 作用于 ssDNA和 RNA，對 5’端的突起核苷酸作用速度為 GCAT 2. 與 S1酶的不同點 最適 pH接近中性，不會產(chǎn)生切口 。 不使具切口的dsDNA斷裂 3. 用途： 與 S1酶相同 六 . 外切酶 Ⅶ 作用于 ssDNA的 3’ 與 5’端，產(chǎn)物為低聚核苷酸 除去單鏈 DNA形成平整末端 七 . 牛脾磷酸二酯酶 作用含 5’羥基端的 ssDNA和 RNA， 產(chǎn)生 3’單磷酸核苷 用于短鏈 RNA和 DNA的定序分析 八 . 蛇毒磷酸二酯酶 作用 3’羥基單、雙鏈 DNA和 RNA，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷 用于 RNA和 DNA的定序分析 表 4 幾種常用外切酶的特點 外切酶 作用方向 作用底物 反應(yīng)產(chǎn)物 ExoIII 3’→ 5’ dsDNA 單核苷酸 λ外切酶 5’→3 ’ ss和 dsDNA 同上 Bal31 3’→5’ 和 5’→3 ’ ss和 dsDNA, RNA 同上 S1 3’→5’ 和 5’→3 ’ ssRNA和 ss DNA 低、核苷酸 綠豆核酸酶 3’→5’ 和 5’→3’ ssRNA 和 ss DNA 同上 Exo VII 3’→5’ 和 5’→3’ ssDNA 低聚核苷酸 牛脾磷酸二酯酶 5’→3’ ssRNA ， ss DNA 同上 蛇毒磷酸二酯酶 3’→ 5’ ss， ds RNA和 DNA 同上 九 . RNase 大部分用于 RNA的核苷酸序列分析或除去 DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的 RNA分子。 RNase的識別序列和特點見 表 5。 1. RNase A分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（ 100℃ 加熱 15min仍具活性） , 用于除去 DNA樣品中的 RNA分子 2. 核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對 RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源 mRNA 十 . RNase H 作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫建立時除去 DNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。 表 5 核糖核酸酶反應(yīng)特點 核酸酶 特異性反應(yīng) 核酸酶 特異性反應(yīng) A Pyp/N PhyM Ap/N或 Up/N CL3 Cp/N, Ap/N和 Cp/N Cp/N, Up/N T1 Gp/N P1 無特異性反應(yīng) T2 無特異性反應(yīng) S7 Np/A和 Np/U U2 Pup/N或 Ap/N Phy1 Ap/N,Gp/N和 Up/N 十一 . DNase I 1. 特點： 具內(nèi)切酶活性，作用于 ds DNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生 5’P低聚核苷酸 。 Ca2+ , Mg 2+ 或 Ca2+ , Mn2+可使酶活達(dá)最大值 當(dāng)酶濃度很低時， ds DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響： Mg 2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關(guān) Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置 2. 用途 1) 切口移位，制備 DNA探針 2) 制備 RNA樣品時除去 DNA分子 3) 基因突變時產(chǎn)生切口 Mn++存在時 Mg++存在時 DNaseI 作用特點 DNaseI HO P 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ DNaseI與 Pol I 的 切口移位 Pol I 第四節(jié) DNA 聚 合 酶 一 . DNA聚合酶 I（ polI） 1. 的 DNA聚合酶系統(tǒng) Pol I 參與 DNA修復(fù) , 具 3’→5’ 和 5’→3 ’外切酶活性 pol II 同上 具 3’→5’ 外切酶活性 pol III 參與 DNA復(fù)制 , 具 3’→5’ 和 5’→3 ’外切酶活性 2. polI的特點 1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5’→3 ’外切酶活性，大片段具 3’→5’ 外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 , polIK) 2） 聚合酶活性， 5’→3 ’, 要求 3’OH引物和模板 DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響（表 6） 3） 外切酶活性 3. 用途 1） 除去 3’端突起的單鏈 DNA（在無 dNTP時） 2） 補(bǔ)齊 5’突起端 3） 合成第二條 cDNA 4） 切口移位制備探針 其中用途 2) 和 3)常用大片段 表 6 DNA PolI 的延續(xù)性 DNA模板 引物類型 反應(yīng)條件 延續(xù)性 (堿基數(shù) ) 切口 ColE1 37176。 C, 低鹽 8 缺口 ColE1 37176。 C, 低鹽 47 切口 /缺口胸腺 DNA 37176。 C, 低鹽 24 poly d(AT) 37176。 C, 低鹽 188 poly d(AT) 5176。 C, 低鹽 14 poly d(AT) 5176。 C, 高鹽 3 二 . T4 DNA聚合酶 1. 特點： 5’→3 ’聚合酶活性， 1500 nt/min, 為 pol I的兩倍 3’→5’ 外切酶活性，可作用于 ssDNA和 dsDNA, 其切除速度分別為 40和 4000nt/min 2. 用途： 制備高比活性探針 (1010 cpm/μgDNA)。 DNA末端修飾 缺失 5’CAGCAACGT 3’ dATP CAGCAACGT 3’ S1 T 3’ 3’GTCGTTGCA 5’T4聚合酶 A 5’ A 5’ 外切酶活性 聚合酶活性 無 dNTP dNTP 三 . 反轉(zhuǎn)錄酶 1. AMV反轉(zhuǎn)錄酶 1） 結(jié)構(gòu)與酶活性 反轉(zhuǎn)錄酶以 α， αβ， ββ形式存在，其中 β（無活性） → P32（內(nèi)切酶活性） +α→ 聚合酶 + P24（ RNase H活性），各步反應(yīng)由蛋白酶催化 2） 聚合酶活性 a. RNA， DNA引物 （ 大于 8 nt） → cDNA鏈 b． DNARNA引物 → 互補(bǔ) DNA鏈 c． (rA)1100→(dT) 1218→(dT) n or (rc)n..dG n→(dG) n 反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)和活性 ββ αβ α P24 190 kD 160 kD 65 kD 24 kD P32 RNaseH 聚合酶 5’ AAAAA3’ 引物 5’ AAAAA 3’ TTTTT 5’ 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 全長 cDNA 提前終止反應(yīng) 2. MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 1) 特點： 不具內(nèi)切酶活性 。 RNase H活性低 。 穩(wěn)定性差 2) 與 AMV反轉(zhuǎn)錄酶比較 a．合成短鏈 cDNA( kb)時，兩者相同，但 M MLV反轉(zhuǎn)錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關(guān) b．合成長鏈 cDNA( kb)時，它比 AMV反轉(zhuǎn)錄酶有效得多，這與它無內(nèi)切酶活性有關(guān)。 3) 用途 a. cDNA合成用于文庫建立 。 b.