酶蛋白的結構ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-01 20:21 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 能水解 。 ? 分離肽鏈可用：分子篩；離子交換；等點聚焦 （ 電泳法 ） 7. 測定各個肽段的氨基酸順序 ? 測定肽段的氨基酸順序的方法有： Edman降解法 、 酶解法 、 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法等 ， 其中最常使用的是Edman降解法 。 ? Edman 降解法的原理是利用前述苯異硫氰酸酯（ PITC） ， 又稱 Edman試劑與 N末端氨基酸殘基的 α氨基之間的特異性反應 ， 每輪反應后 N末端氨基酸脫落 ， 并生成 PTH氨基酸 。 通過層析等方法鑒定 PTH氨基酸的種類 ， 就可以確定肽鏈中對應位置的氨基酸 。通過 n輪反應 ， 即可確定由肽段中 N末端起 n個氨基酸的順序 。 多肽鏈的氨基酸順序 ? 至此 ， 已經(jīng)得出了多肽鏈被斷裂成的各個肽段的氨基酸順序 ， 但由于沒有這些肽段在多肽鏈中次序的信息 ，還是無法排出整個多肽鏈的氨基酸順序 。 為此 ， 必須用兩種或者兩種以上的方法來斷裂多肽鏈 ， 比如用兩種蛋白酶分別水解多肽鏈 ， 將得到兩套斷裂位點不同的肽段 ， 分別確定這兩套肽段的氨基酸順序 ， 然后利用這兩套肽段的氨基酸順序彼此之間有交錯重疊 ， 可以確定整條多肽鏈的氨基酸順序 。 ?通過末端分析得到： N末端殘基為 I， C末端殘基為 L ?用胰蛋白酶水解得到第一套肽段 ， 測定出氨基酸順序分別為： ? MTYAGK ISR EAL CAFR DALK ?用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段 ， 測定出氨基酸順序分別為： ? TY REAL AGKDAL ISRM KCAF ? 由于 N末端殘基為 I， ISR和 ISRM是 N末端肽段；又由于 C末端殘基為 L， EAL和 REAL是 C末端肽段 。利用兩套肽段的氨基酸順序彼此之間的重疊關系 ， 得出： ? 第一套肽段： N末端 ISR MTYAGK DALK CAFR EAL C末端 ? 第二套肽段： N末端 ISRM TY AGKDAL KCAF REAL C末端 ? 推出完整肽鏈順序： ISRMTYAGKDALKCAFREAL ? 在上例中 ， 兩套肽段之間正好能夠相互跨過切口而重疊 ， 從而能確定出肽段在多肽鏈中的位置 ， 拼湊出整條肽鏈的氨基酸順序 。 ? 9. 多肽鏈中二硫鍵位置的確定 ? 對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì) ， 我們在分析多肽鏈氨基酸順序前先將其拆開 ， 然而在測定完多肽鏈氨基酸順序后需要確定鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的位置 ， 常用的方法是 對角線電泳法 。 不拆開二硫鍵直接用蛋白酶水解蛋白質(zhì) ， 所得肽段樣品點樣到濾紙中央的電泳原點 ， 在第一個方向上進行電泳 ， 則不同的肽段按其所帶電荷和分子大小分離 。 結束后將濾紙在過甲酸蒸氣中熏 ， 二硫鍵被氧化和拆開 。 將濾紙旋轉(zhuǎn) 90176。 ， 在相同條件下進行第二個方向上的電泳 。 這時 ， 對于不含二硫鍵的肽段 ， 由于沒有發(fā)生變化 ， 電泳遷移率不變 ， 電泳后位置應處于對角線上；而含有二硫鍵的肽段 ， 其大小和電荷發(fā)生了變化 ， 電泳遷移率也要改變 ， 電泳后位置偏離對角線 ， 將這些肽段提取出來 ， 進行氨基酸順序分析 ， 與已經(jīng)測定的多肽鏈氨基酸順序相比較 ， 即可推斷出二硫鍵的位置 。 ?除了上述經(jīng)典的蛋白質(zhì)一級結構測定方法外 ，由于核苷酸序列測定技術發(fā)展迅速 ， 目前 DNA的核苷酸序列測定已完全實現(xiàn)自動化 ， 而蛋白質(zhì)的氨基酸順序是由 DNA所決定的 ， 人們通過提純指導蛋白質(zhì)合成的 mRNA， 再將 mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄作用得到 cDNA， 并擴增 cDNA， 然后測定其核苷酸序列 ， 根據(jù)三聯(lián)體遺傳密碼規(guī)則可確定出蛋白質(zhì)的氨基酸順序 。 ?到目前為止，已有 10萬種以上的蛋白質(zhì)完成了一級結構的測定，對于大多數(shù)常見蛋白質(zhì)，通過查閱數(shù)據(jù)庫，可得到關于一級結構的資料。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)空間結構的研究方法 ? 二級結構： a螺旋 （ ahelix) ； b片層 (βsheet) ； b轉(zhuǎn)角 (βturn) ； 無規(guī)卷曲 (random) ? 維持鍵：氫鍵 、 疏水鍵 、 范德華力 、 離子鍵 、 配位鍵等 ? R基團對 a螺旋的影響： a) 構成 a螺旋要求
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