酶的生物改造ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-01 20:18 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 DNA為模板，以隨機序列引物進行 PCR反應(yīng)，再除去模板，互為模板和引物進行裝配和擴增 有性進化 :交錯延伸法 （ 1997， Arnold) 將常規(guī)的退火和延伸合并成一步，縮短反應(yīng)時間 基因家族的同源重組 ? 方法 ：單一酶分子基因進化過程中集中有利突變速度較慢，從自然存在的基因家族出發(fā)，由于基因之間存在顯著差異，所得突變庫體現(xiàn)了基因多樣性和增加了有利突變的概率； ? 實例 ： Stemmer等從 4種微生物中選擇編碼頭孢菌素的 4個同源基因，分別進行單獨進化和同源重組，結(jié)果單獨進化抗性提高 8倍、而同源重組比其中 2種微生物分別提高 270和 540倍； 國內(nèi)海藻糖的酶法制備即采用該方法； ? 特點 ：由于定向進化的高效性，被認為是 DNA改組的發(fā)展方向； The Molecular Breeding directed molecular evolution process ? 對一組同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行比較，以一 定的標(biāo)準(zhǔn)程序計算出各氨基酸序列的共有序列； ? 人工合成同序基因后重組表達。 Martin Lehmann等（ 2022～ 2022）把這種方法應(yīng)用在真菌植酸酶家族設(shè)計合成了同源植酸酶基因，并表達出具熱穩(wěn)定性的同源植酸酶。 外顯子改組 ? 真核基因中外顯子編碼一個折疊結(jié)構(gòu)域，故內(nèi)含子（轉(zhuǎn)錄后被剪切剩下外顯子）間的重組，可使獨立外顯子組裝成編碼新蛋白質(zhì)的基因，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的快速進化； ? 在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，導(dǎo)致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一。與 DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而 DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上； 雜合進化 ? 把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是整個酶分子進行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的酶雜合體。 ? 纖維素酶定向進化 定義 ：通過 DNA重組技術(shù)將隨機突變獲得的各種突變基因與適宜載體進行重組，獲得重組載體；再通過細胞轉(zhuǎn)化等方法將重組載體轉(zhuǎn)入合適的細胞或進行體外包裝成為有感染活性的重組 噬菌體，形成突變基因文庫。 ?載體的選擇 ：質(zhì)粒載體 噬菌體 DNA載體 : λ噬菌體、 M13噬菌體 黏粒載體： 人工構(gòu)建的載體 噬菌粒載體 ?基因重組 ： 體外通過 DNA連接酶的作用，將基因與載體 DNA連接在一起形成重組 DNA的過程。 ? 重組方法 ：黏性末端連接 平頭末端連接 修飾末端連接 ?組裝突變基因文庫 將重組 DNA轉(zhuǎn)入受體細胞或包裝成為有感染活性的重組噬菌體的過程。 ? 組裝方法： 重組質(zhì)粒載體 轉(zhuǎn)化（原核和真核） 重組噬菌體載體 包裝 基因突變庫的篩選方法 ?目標(biāo) 根據(jù)定向進化要求，在一定的環(huán)境要求下進行篩選，從突變基因文庫中得到所需的突變基因。 ?難點 突變庫容量大，一般達到 106，工作量巨大 ?關(guān)鍵 高通量篩選：通量大，效率高 ?方法 平板篩選法，熒光篩選法，噬菌體表面展示
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