【文章內(nèi)容簡介】 ctroporation：用高壓脈沖電流擊破細胞膜，或擊成小孔，使各種大分子（包括DNA ）能通過這些小孔進入細胞。 冰浴 10min 三 .轉(zhuǎn)導(dǎo) （ transduction） ? 定義： 以溫和噬菌體為媒介，將供體細胞的 DNA片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。 ? 獲得新遺傳性狀的受體細胞，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 [] 混合培養(yǎng) A （ 1952）在 Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）中發(fā)現(xiàn)的。 A B [] [] Try+his+ Tryhis+ Try+his 色氨酸缺陷型 色氨酸野生型 完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo) 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) （ generalized transduction） ? 定義 ： 通過 完全缺陷噬菌體 對供體菌 任何 DNA小片段 的 “ 誤包 ” 而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象 ， 稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 ? 1952年發(fā)現(xiàn) ， 在 Salmonella typhimurium中存在轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象 。 ： ? 以其野生型菌株作為供體菌 ? 營養(yǎng)缺陷型菌株作為受體菌 ? P22噬菌體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介 ， 對供體菌是烈性噬菌體 ， 對受體菌是溫和噬菌體 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) 完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 沒有形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程 1 噬菌體浸染供體菌 2噬菌體發(fā)生增殖 ,同時把供體菌的部分 DNA降解成許多小片段 3 包裝 ,發(fā)生錯誤包裝(噬菌體中的 DNA全是供體菌的 DNA,完全缺陷型 ) 4完全缺陷型侵染受體菌 ,將供體菌的基因整合進受體菌 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) ? 特點： ? 噬菌體對供體菌和受體菌都是溫和噬菌體 ? 只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個別特定基因（一般為噬菌體整合位點兩側(cè)的基因） ? 缺陷噬菌體是由于其在形成過程中所發(fā)生的低頻率（約 10 – 5） “ 誤切 ” ，或由于雙重溶源菌的裂解而形成（約形成 50%缺陷噬菌體） ? 分類：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)與高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) ?定義：通過 部分缺陷的溫和噬菌體 把供體菌的少數(shù)特定 基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。 部分缺陷的噬菌體 前噬菌體 脫落 復(fù)制 部分缺陷的噬菌體 局限性低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程 gal bio gal bio 宿主基因組 整合 不正常切離 （ 104—106） 正常切離 λ 正常 λ λ dgal λ dbio 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（ LFT）裂解物的形成 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制 ” 雜種形成模型 ” ? 在轉(zhuǎn)導(dǎo)中，從宿主染色體上切離時發(fā)生不正常切離的頻率極低，故這種裂解物中的部分缺陷噬菌體的比例是極低的（ 10 – 6）。 ? 用 LFT裂解物感染宿主，可獲得極少量的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子，即低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。 特點 :誘導(dǎo)的一般都是溶源菌 (供體菌 ) 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) （ LFT， low frequency transduction） ? 特點 :誘導(dǎo)的是 雙重溶源菌 ? λ與 λdgal(含有供體菌 gal基因的部分缺陷噬菌體 )同時整合在一個受體菌的核染色體組上 , 成為一個 雙重溶源菌 （ double lysogen） 。 ? 當被紫外線等誘導(dǎo)時 ,正常 λ噬菌體的基因可補償 λdgal缺失的部分基因功能 ,兩種噬菌體就同時獲得復(fù)制的機會 .所以在雙重溶源菌中的正常 λ 噬菌體被稱為助體 （ 或輔助 ） 噬菌體 （ helper phage） ? 雙重溶源菌的裂解物中含有等量的 λ和 λdgal粒子 ,稱為 HFT（ 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) ） 裂解物 。 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) （ HFT， high frequency transduction） 部分缺陷的噬菌體 前噬菌體 脫落 復(fù)制 部分缺陷的噬菌體 局限性低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程 雙重溶源菌 : 含 ?噬菌體和?dgal部分缺陷體 含有供體 gal+基因 ?噬菌體正常脫落 裂解 ,釋放 ,形成噬菌斑 轉(zhuǎn)導(dǎo)子 雙重容源菌 【 (??/??dg)】 ① 轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（ ?dg） + ② 輔助噬菌體（ ? ） 轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌落 噬菌斑 . 附 比較項目 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因 供體染色體或染色體外的任何基因 供體染色體上與原噬菌體緊密連鎖的少數(shù)幾個個別基因 噬菌體形成 錯誤的包裝 雜種形成模型 噬菌體的名稱 完全缺陷噬菌體 部分缺陷噬菌體 轉(zhuǎn)導(dǎo)子 一般穩(wěn)定，非溶原性 一般不穩(wěn)定，呈缺陷溶原性 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的比較 Conjugation Transformation Transduction 原生質(zhì)體融合 （ protoplast fusion） 概念： 將雙親株的微生物細胞分別通過酶解去壁，形成原生質(zhì)體，然后在高滲條件下混合，并加入物理的、化學的或生物的助融條件，使雙親株的原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集和融合的過程 ? 可以提高重組率 ? 可進行多親本融合 ? 有利于不同種間、屬間微生物的雜交 ? 通過原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)量 原生質(zhì)體融合的優(yōu)點： 原生質(zhì)體融合技術(shù)的理論與應(yīng)用價值 ?打破了微生物的種屬界限，可以實現(xiàn)遠緣菌株的基因重組 ?用于改良菌種特性、提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量、使菌種獲得新的性狀、合成新的產(chǎn)物等 ?可用來探索重大理論問題，研究外源 DNA轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移以及核與核、核與質(zhì)之間的關(guān)系 原生質(zhì)體融合技術(shù)及育種步驟 ?原生質(zhì)體的制備 ?原生質(zhì)體再生 ?原生質(zhì)體融合 ?融合子的檢出與鑒定 原生質(zhì)體融合操作示意圖 ? 去壁 ? ? [A+B] （高滲下） [A+B] ? PEG或電脈沖 ? 離心促融 ? 去壁 ? ? [AB+] （高滲下） [AB+] ? 融合子（ AA, BB, AB）長成菌落 []檢出 [A+ B+]融合子 ? 篩選優(yōu)良性狀的融合子 甲 乙 ?有性生殖 ?異核現(xiàn)象 ?準性生殖 二、真核微生物的基因重組 一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。 凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，都能采用有性雜交方法進行育種。 （一）有性雜交 質(zhì)配 核配 先有絲分裂 再減數(shù)分裂 子囊孢子的繁殖 （二）異核現(xiàn)象 ? 概念：在一些真菌菌絲體的菌絲細胞內(nèi)存在一個以上不同遺傳型細胞核的現(xiàn)象 ? 原因：基因突變或不同遺傳型菌絲之間的聯(lián)合，導(dǎo)致細胞質(zhì)或細胞核轉(zhuǎn)移 (三）準性生殖 準性生殖的概念： 不產(chǎn)生有性孢子的絲狀真菌，不經(jīng)過減數(shù)分裂就能導(dǎo)致染色體單元化和基因重組的過程。 1953年發(fā)現(xiàn) 準性生殖與有性生殖的不同 ?重組體細胞和營養(yǎng)體細胞相同，不產(chǎn)生特殊的囊器 ?染色體的交換及單倍體化過程沒有規(guī)律 準性生殖的過程 ?異核體的形成 ?核融合和雜合二倍體的形成 ?單倍體化 ① 菌絲聯(lián)結(jié) ②異核體形成（質(zhì)配） ③核配形成雜合二倍體 ④體細胞交換和單倍體化 。 體細胞交換和單倍體化 雜合體細胞中有極少數(shù)細胞核在進行有絲分裂的過程中，能發(fā)生體細胞染色體間的交換、分離導(dǎo)致個別染色體減半，直到最后形成單倍體的過程，而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子 A B A+B （同核體） （異核體） A A B B AB A A B