【文章內(nèi)容簡介】 涂 T1噬菌體平板 結(jié)果表明 ： 來自甲管的 50皿中 ,各皿間抗性菌落數(shù)相差極大 (圖左 ),而來自乙管的則各 皿數(shù)目基本相同 (圖右 )。 原因分析： ,不是由所抗的環(huán)境 因素 —— 噬菌體誘導(dǎo)出來的 ,而是在它接觸到噬菌體前 ,在某一次細(xì)胞分裂過程中隨機(jī)地自發(fā)產(chǎn)生的 。 這一自發(fā)突變發(fā)生得越早 ,則抗性菌落出現(xiàn)得越多 ,反之則越少 ,噬菌體在這里僅起著淘汰原始的未突變的敏感菌和鑒別抗噬菌體突變型的作用。 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969 涂布試驗 (Newbe,1949) 涂布敏感菌 5 104個 共 12個平板 5 104個菌落 5000個細(xì)菌 /菌落 噴入 T1保溫 重新涂布后 噴入 T1保溫 6個平板共 353個菌落 6個平板共 28個菌落 實驗結(jié)果 ： 在涂布過的一組中 ,共有抗性菌落 353個 ,要比未經(jīng)涂布過的 (僅 28個菌落 )高得多。 原因分析： 該抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體前。 噬菌體的加入只起甄別這類突變是否發(fā)生的作用，而不是誘導(dǎo)突變的因素。 影印培養(yǎng) 無鏈霉素 培養(yǎng)基 含鏈霉素 培養(yǎng)基 影印培養(yǎng)試驗 (J. Lederberg,1952) 原始敏 感菌種 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 由此可知 ： 原始的鏈霉素敏感菌株只通過(1)→(2)→(4)→(5)→(6)→(8)→(9) →(10)→(12) 的移種和選擇序列 ,就可在根本未接觸鏈霉素的情況下 ,篩選出大量的抗鏈霉素的菌株。 J. Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958 （五）基因突變及機(jī)制 基因突變機(jī)制多種，可是自發(fā)的或誘發(fā)的。 誘發(fā)突變包括影響一對基因的點突變和影響一段染色體的畸變。 誘發(fā)突變 ：通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或 生物因素顯著提高基因突變頻率的手段。 2）誘發(fā)突變機(jī)制 ? （ 1）堿基置換（ substitution) ? （ 2）移碼突變 (frameshift mutation) ? （ 3）染色體畸變（ Chromosomal aberration) 堿基的置換 轉(zhuǎn)換 （ transition） 顛換（ transversion） 一個嘌呤 另一個嘌呤 一個嘧啶 另一個嘧啶 一個嘌呤 另一個嘌呤 一個嘧啶 另一個嘧啶 堿基的置換： 一對堿基被另一對堿基置換 直接引起置換的誘變劑 HNO2 C NH2 腺嘌呤 C O 次黃嘌呤 (Hk) A .. T He .. T Hk .. T Hk .. C A .. T Hk .. C G .. C C OH 次黃嘌呤 (He) HNO2，羥胺，各種烷化劑 間接引起置換的誘變劑 堿基的置換 C O H T：烯醇式 C T ： 酮式 O A .. T T .. A G .. C A .. T 酮式 T .. G 烯醇式 堿基類似物 移碼突變 （ frameshift mutation， phaseshift mutation） 指誘變劑使 DNA序列中的一個或少數(shù)幾個核苷酸發(fā)生 增添 （ 插入 ） 或 缺失 ，從而使其后面的全部遺傳密碼發(fā)生 閱讀框 發(fā)生改變，并進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。 移碼突變 ＤＮＡ分子中缺失或增加少數(shù)幾個堿基對而引起 造成突變點以后全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)釋發(fā)生錯誤 ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC AB+ ABC ABC CBA CBA CBA CBA CBA ABC BCA BCA BCA BCA BCA BCA BCA 增添一個堿基 缺少一個堿基 丫啶類染料、 ICR化合物 染色體畸變（ chromosomal aberration） 電離輻射 （ X射線等 ） 烷化劑 亞硝酸等 某些強(qiáng)烈理化因子 引起 點突變 DNA的大損傷 （ macrolesion） DNA的大損傷 （ macrolesion） 染色體畸變 缺失 （ deletion） 重復(fù) （ duplication） 插入 （ insertion） 易位 （ translocation） 倒位 （ inversion） 染色體結(jié)構(gòu)上 染色體數(shù)目的變化 轉(zhuǎn)座 （ transposition）： DNA序列通過 非同源重組 的方式，從染色體某一部位轉(zhuǎn)移到 同一染色體上另一部位 或 其他染色體上某一部位 的現(xiàn)象。 凡具有轉(zhuǎn)座作用的一段 DNA序列，稱 轉(zhuǎn)座因子 （ transposible element， TE），又稱 跳躍基因 （ jumping gene）、 可移動基因 （ moveable gene）、 可移動遺傳因子 （ mobile geic element）。 轉(zhuǎn)座因子 插入序列 （ insertion sequence， IS） 轉(zhuǎn)座子 （ transposon， Tn） Mu噬菌體 （ mutator phage） 轉(zhuǎn)座噬菌體 （ transposable phage） 原核生物 E. coli 轉(zhuǎn)座因子的特點 ① 在轉(zhuǎn)座時，通過轉(zhuǎn)座因子的復(fù)制，可將新形成的拷貝以非同源重組的方式轉(zhuǎn)移到染色體的新部位上； ② 在轉(zhuǎn)座因子兩端各有一段一定長度的末端重復(fù)序列，包括 正向重復(fù) （ direct repeat）和 反向重復(fù) （ inverted repeat，或 顛倒重復(fù) ）； ③ 每個轉(zhuǎn)座因子還帶有一個對轉(zhuǎn)座有特異功能的 轉(zhuǎn)座酶基因 （ transposase gene）。 紫外線誘變作用機(jī)理 可使ＤＮＡ鏈裂斷，破壞核糖和磷酸間的鍵聯(lián) 引起胞嘧啶和尿嘧啶產(chǎn)生水合作用造成氫鍵斷裂 能使胸腺嘧啶成二聚體，使ＤＮＡ結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 把經(jīng) UV照射后的微生物 立即 暴露于 可見光 下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為 光復(fù)活作用 。 光復(fù)活作用 （ photoreactivation， photorestoration） 最早是 A. Kelner（ 1949）在 Streptomyces griseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許多微生物中都得到了證實。 最明顯的是在 ① 對照： 8 106個／ 100個／ ② 試驗： 8 106個／ 2 106個／ UV UV 360～ 490nm 可見光， 30min 使二聚體（ dimer）重新分解成單體（ monomer） 帶有嘧啶二聚體的 DNA分子 DNA分子 UV照射 黑暗下結(jié)合 光激活酶 —— 光解酶 （光裂合酶， photolyase） 復(fù)合物 300～ 500nm可見光 獲得光能而激活 釋放光解酶 在一般的微生物中都存在光復(fù)活作用，在利用 UV進(jìn)行誘變育種等工作時，應(yīng)在 紅光下 進(jìn)行照射和后續(xù)操作，并放置在 黑暗條件下培養(yǎng) 。 注 意 突變與育種 自發(fā)突變與育種 從生產(chǎn)中選育 定向培育優(yōu)良品種 誘變育種 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 誘變育種的原則 誘變育種： 是指用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變頻率顯著提高的基礎(chǔ)上，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株，以供科學(xué)實驗或生產(chǎn)實踐使用。 篩選 誘變 誘變育種 定向的 —— 更重要 隨機(jī)的 誘變育種的特點 （ 1）提高突變率，擴(kuò)大突變譜 （ 2）有效地改良個別、單一性狀 （ 3）縮短育種年限 （ 4）定向變異和有益突變的頻率低 誘變育種的過程 ? （ 1）選擇合適的出發(fā)菌株 ? （ 2）制備待處理的菌懸液 ? （ 3）誘變處理 ? （ 4）篩選 ? （ 5）保藏和擴(kuò)大試驗 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 大多死亡 少數(shù)存活 存活率 多數(shù)未變 少數(shù)突變 突變率 多數(shù)負(fù)變 少數(shù)正變 正變率 多數(shù)幅度小 少數(shù)幅度大 高產(chǎn)率 投產(chǎn)率 多數(shù)不宜投產(chǎn) 少數(shù)適宜投產(chǎn) 出發(fā)菌株 計算出 誘變 出發(fā)菌株 純化、同步培養(yǎng) 培養(yǎng)液 離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液玻璃珠打散，過濾 細(xì)胞或孢子懸液 誘變處理 平板分離 初篩 復(fù)篩 保藏及擴(kuò)大試驗 活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗 存活細(xì)胞計數(shù)，致死率計算 變異率計算 誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個原則 選優(yōu)良的出發(fā)菌株 選擇簡便有效的誘變劑 處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液 選用最適劑量 設(shè)計或采用高效篩選方案或方法 利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng) 利用和創(chuàng)造形態(tài)，生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo) 選擇簡便有效的誘變劑 :紫外線、亞硝基胍 出發(fā)菌株 含誘變劑的液體培養(yǎng)基 接種 培養(yǎng) 培養(yǎng) 接種分離 紫外線 選擇優(yōu)良突變株 艾姆氏試驗 ： 是一種利用細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變來檢測環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑的簡便有效方