【文章內(nèi)容簡介】 . 6. 耐高糖耐高谷氨酸 . 7. CO2固定能力強 . 8 .解除谷氨酸反饋抑制 . 9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力 . 谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜的通透性 ? 通過用能積累谷氨酸菌株做實驗 ，結(jié)果表明：谷氨酸的分泌是由細(xì)胞膜控制 ? 控制細(xì)胞膜通透性的方法： 1. 控制磷脂的合成； 2. 控制細(xì)胞壁的合成；選育溫敏突變株 （ 1）生物素營養(yǎng)缺陷型 ? 作用機制 :生物素是脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶 乙酰 CoA羧化酶 的輔酶 ,參與了脂肪酸的合成 ,進而影響脂肪酸的合成 .當(dāng)磷脂合成量少到正常的 1/2左右時 ,細(xì)胞變形 ,Glu向膜外泄漏 . ? 控制關(guān)鍵 :使用該類突變株必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素 亞適量 (510?g/L).在發(fā)酵初期 (08小時 ),細(xì)胞正常生長 ,當(dāng)生物素耗盡后 ,在菌的再次倍增時 ,開始出現(xiàn)異常形態(tài)細(xì)胞 ,即完成了細(xì)胞從生長型到積累型轉(zhuǎn)換 . 突變株 （ 2）油酸營養(yǎng)缺陷型 ? 作用機制 :油酸營養(yǎng)缺陷型喪失了合成油酸的能力 ,通過控制油酸使磷脂合成量減少到正常量的 1/2左右 . ? 控制關(guān)鍵 :保證在培養(yǎng)基中油酸 亞適量 ,完成細(xì)胞從生長型到生產(chǎn)型的轉(zhuǎn)換 . 其他 （ 3）添加表面活性劑 ? 添加 表面活性劑 (如吐溫 60)或 不飽和脂肪酸(C1618),也能造成細(xì)胞滲漏 ,積累谷氨酸 . ? 機理 :兩者在脂肪酸合成時 對生物素 有 拮抗 作用 ,導(dǎo)致 磷脂 合成不足 ,形成不完整的細(xì)胞膜 . ? 關(guān)鍵 :控制好脂肪酸或表面活性劑的時間和濃度 ,必須在藥劑加入后 ,在這些藥劑存在下進行分裂 ,形成產(chǎn)酸型細(xì)胞 . 其他 （ 4）添加青霉素 ? 機理 :青霉素抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞壁后期的合成 ,細(xì)胞膜在失去保護 ,在滲透壓的作用下受損 ,向外泄露谷氨酸 . ? 控制關(guān)鍵 :一般在進入對數(shù)生長期的早期 (36小時 )添加 .添加青霉素后倍增的菌體不能合成完整的細(xì)胞壁 ,完成細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)換 . 其他 谷氨酸發(fā)酵強制控制工藝 ? 為了穩(wěn)產(chǎn) ,克服培養(yǎng)基原料中某些成分不易控制帶來的影響 ,在谷氨酸發(fā)酵時可采取 “ 強制控制 ” 的方法 ,如 :―高生物素 高吐溫 ” 或 “ 高生物素 高青霉素 ” 的方法 . ? 控制方法 :在發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)先配加一定量 (過量 )的純生物素 ,大大地削弱每批原料中生物素含量變化的影響 ,高生物素、大接種量能促進菌體迅速增殖 .再在菌體倍增的早期加入相對高的吐溫或青霉素 ,形成產(chǎn)酸型細(xì)胞 .固定其它條件 ,確保高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。 其他 谷氨酸發(fā)酵 ? :尿素分解出氨使 pH上升 .糖不利用 .24h. 措施 :接種量和發(fā)酵條件控制使 適應(yīng)期縮短 . ? :糖耗快 ,尿素大量分解使 pH上升 ,氨被利用 pH又迅速下降 .溶氧急劇下降后維持在一定水平 .菌體濃度迅速增大 ,菌體形態(tài) 為排列整齊的八字形 .不產(chǎn)酸 .12h. 措施 :及時供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié) pH,在 。維持溫度 30 32℃ 谷氨酸發(fā)酵 ? :谷氨酸合成 . 措施 :提供必須的氨及 pH維持在 **,控制溫度 3437 ℃. ? :菌體衰老 ,糖耗慢 ,殘?zhí)堑?. 措施 :營養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時 ,及時放罐 . 發(fā)酵周期一般為 30h. ** 某醋廠轉(zhuǎn)產(chǎn)用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，結(jié)果代謝產(chǎn)物沒有谷氨酸而產(chǎn)生了乳酸及琥珀酸，其原因是：溶氧不足 谷氨酸發(fā)酵 ?谷氨酸除用于制造味精外還可用于治療神經(jīng)衰弱及配制營養(yǎng)注射液，應(yīng)用前景廣泛。 二、谷氨酸發(fā)酵的生化過程 ? （ 1）是代謝控制發(fā)酵的典型代表 ? （ 2）是目前代謝控制發(fā)酵中，在理論與實踐上最成熟的 …… ? 整個過程可簡單的分為 2 個階段 : ? 第 1階段是菌體生長階段 。 ? 第 2階段是產(chǎn)酸階段 ,谷氨酸得以大量積累。 三、合成谷氨酸的 生化途徑 葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 檸檬酸 琥珀酸 透過細(xì)胞膜 異檸檬酸 α 酮戊二酸 谷氨酸 谷氨酸 （一）、 GA 的生物合成途徑 ? 主要有： Glucose的酵解， EMP Glucose的有氧氧化， HMP 丙酮酸的有氧氧化， TCA循環(huán) 乙醛酸循環(huán)途徑， DCA循環(huán) CO2固定反應(yīng) α酮戊二酸（ α KGA）的還原氨基化 ? 這 6條途徑之間是相互聯(lián)系和相互制約的，如圖所示： C6H12O6 HMP 3磷酸甘油醛 丙 酮 酸 乙酰輔酶 A CO2 草酰乙酸 檸 檬 酸 蘋果酸 異檸檬酸 延胡索酸 琥珀酸 NADPH αKGA NADPH NH4+ 谷氨酸 乳酸 GA 的生物合成途徑 乙酰輔酶 A 乙醛酸循環(huán) 乙醛酸 EMP TCA 谷氨酸 CO2固定 透過 細(xì)胞膜 αKGA的還原氨基化 87 （二）、 GA生物合成的 內(nèi)在因素 ? 從上圖可以看出，菌體要在葡萄糖含量10%以上的培養(yǎng)基上，合成 5%以上的谷氨酸，是一種不正常的現(xiàn)象，顯然 GA產(chǎn)生菌必須具備以下條件： 谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征 —內(nèi)在因素 ? 1 生物素缺陷型 ? 谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型 ,谷氨酸發(fā)酵時 ,通過控制生物素 亞適量 (貧乏量 ) ,引起菌種代謝失調(diào) , 使谷氨酸得到大量積累。 ? 2 具有 CO2 固定反應(yīng)的酶系 ? 菌種能利用 CO2 產(chǎn)生大量草酰乙酸 , 有利于谷氨酸的大量積累。 ? 這是菌體生成并積累 α KGA的關(guān)鍵，從上圖可以看出， α KGA是菌體進行 TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，很快在 α KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶 A，在正常的微生物體內(nèi)他的濃度很低，也就是說，由 α KGA進行還原氨基化生成 GA的可能性很少。只有當(dāng)體內(nèi) α KGA脫氫酶活性很低時， TCA循環(huán)才能夠停止， α KGA才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ) 。 4. GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的 NADPH氧化能力欠缺或喪失 ? （ 1）如上圖所示， NADPH是 α KGA還原氨基化 生成 GA必須物質(zhì)，而且該還原氨基化所需要的 NADPH是與 檸檬酸氧化脫羧 相偶聯(lián) 的。 ? （ 2）由于 NADPH的在氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的 NADPH有一定的 積累 ， NADPH對于抑制 α KGA的脫羧氧化 有一定的意義。 5. 產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（ DCA）的關(guān)鍵酶 ——異檸檬酸裂解酶 ? 該酶是一種調(diào)節(jié)酶，或稱為 別構(gòu)酶 ，其活性可以通過某種方式進行調(diào)節(jié)，通過該酶酶活性的調(diào)節(jié)來實現(xiàn) DCA循環(huán)的封閉， DCA 循環(huán)的封閉是實現(xiàn) GA發(fā)酵的 首要條件 。糖的代謝才能沿著 α 酮戊二酸的方向進行 , 從而有利于谷氨酸的積累。 L谷氨酸脫氫酶活性 ? α KGA + NH4+ +NADPH == GA + NADP (NADH :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸； NADPH :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 ) ? L谷氨酸脫氫酶，實質(zhì)上 GA產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性都很強， α 酮戊二酸易生成谷氨酸。 ? 該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)，反應(yīng)機制如下： ? 偶聯(lián)反應(yīng) α KGA NADPH α KGA GA NADP 異檸檬酸 L谷氨酸脫氫酶 異檸檬酸脫羧氧化 （三）、 GA 生物合成的 最理想途徑 ? 1. 在前述 GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（ …… ， 封閉乙醛酸循環(huán) ）體系 不存在 CO2固定反應(yīng) ，則有： ? 3/2 C6H12O6 + NH4+ → C5H9NO4 + 4 CO2 ? 產(chǎn)率： 147 /（ 180*3/2） == % 3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 乙酰輔酶 A + 乙酰輔酶 A + 乙酰輔酶 A 檸檬酸（ DCA循環(huán)封閉） 谷氨酸 不存在 CO2固定反應(yīng) 草酰乙酸 ? GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（ …… ， 封閉乙醛酸循環(huán) ） 存在 CO2固定反應(yīng) ，則有： ? C6H12O6 + NH4+ → C5H9NO4 + CO2 ? 產(chǎn)率： 147 / 180 == % Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 CO2 草酰乙酸 （草酰乙酸羧化酶） 乙酰輔酶 A + C4二羧酸 蘋果酸 （蘋果酸合成酶） 檸檬酸（ DCA循環(huán)封閉） 谷氨酸 存在 CO2固定反應(yīng) 可見，在 GA的生物合成過程中， CO2固定反應(yīng)對于產(chǎn)率的提高有著多么重要的作用。 CO2固定反應(yīng) ? (1)磷酸丙酮酸羧化酶 的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP == 草酰乙酸 + GDP ? (2)蘋果酸酶 的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH === 蘋果酸 + NAD ? 需要 Mn+做催化劑，所以，在 GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補充 Mn+ ? 實際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的 C4二羧酸完全來自于 CO2固定反應(yīng)，體系也不可能完全不存在 CO2固定反應(yīng)，因此， GA 發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應(yīng)在：%%。 ? 目前，國內(nèi)的 GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在 50%以內(nèi) . 100 （ 1）企業(yè)計算的糖酸轉(zhuǎn)化率是把 GA 發(fā)酵前期菌體增殖時期消耗的葡萄糖計算在內(nèi)，而我們所計算的不包括這一部分葡萄糖，通常這一部分糖占總量的 20%左右，當(dāng)然與企業(yè)的技術(shù)水平有關(guān)。 （ 2） TCA 循環(huán)也不可能完全封閉； α KGA也不可能完全轉(zhuǎn)化為 GA；生成的 GA也不可能完全分泌的細(xì)胞外；發(fā)酵液中還存在一定的殘?zhí)?，通常?%%之間。 提高 GA的潛力 ? （ 1） 強化 CO2固定反應(yīng) ，具體措施： Mn+ ，生物素 . ? （ 2） 控制溶氧濃度 是非常重要的 ? 低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化 …… ? 高的溶氧濃度，則 NADPH 有被氧化的可能， …… （四）、生物素對 GA發(fā)酵的影響 ? GA 產(chǎn)生菌大都是生物素的營養(yǎng)缺陷型，即： VH ? 生物素 對發(fā)酵的影響是全面的，在發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制其濃度。 1. 生物素對糖代謝的影響 1. VH對于 糖酵解 有促進作用 。 2. 對丙酮酸的 有氧氧化 —— 乙酰輔酶 A的生成也有促進作用， ? 但兩者的 促進作用不一樣 ，對 前者 大一些 ? 這樣培養(yǎng)基中如果有較豐富的 VH，就會打破糖酵解與丙酮酸氧化之間的平衡，導(dǎo)致 丙酮酸的積累 ，丙酮酸積累則可能導(dǎo)致乳酸的形成， 乳酸生成 ，則使得 碳源利用率降低 ，而且?guī)淼氖前l(fā)酵液的 pH值下降 。 1. 生物素對糖代謝的影響 ? 另一方面，可以通過控制 VH的濃度，以實現(xiàn)對于乙醛酸循環(huán)的封閉。 封閉乙醛酸循環(huán)對于 GA發(fā)酵的重要性 如何封閉乙醛酸循環(huán)呢 ？ ? DCA循環(huán)（ 乙醛酸循環(huán) ）的關(guān)鍵酶是 異檸檬酸裂解酶 ，研究表明，該酶受以下幾個因素的影響： ? 為 醋酸誘導(dǎo) ? 受 琥珀酸阻遏 ，其活性受琥珀酸的抑制 .（受到 Glucose的阻遏） 如何封閉乙醛酸循環(huán)呢 ？ ? 當(dāng) VH缺乏時： ? （ 1） 丙酮酸 的有氧 氧化 就會 減弱 (由于 VH對 TCA循環(huán)的促進作用 )，則： 乙酰輔酶 A的生成量就會 少 ， 醋酸濃度降低 ，它的誘導(dǎo)作用降低； ? （ 2） VH對 TCA循環(huán)的促進作用的降低，使得其中間產(chǎn)物 琥珀酸 的氧化速度降低，其濃度得到積累 ，這樣它的阻遏和抑制作用加強； ? 兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失， DCA循環(huán)得到封閉。 2. 生物素對氮代謝的影響 ? 由以上分析可知， 當(dāng) VH缺乏時，異檸檬酸裂解酶的活性減弱 。 ? 當(dāng) VH豐富時，異檸檬酸裂解酶的活性必然加強 ，則 DCA 循環(huán)（乙醛酸循環(huán)）正常進行， DCA循環(huán)的進行，一方面提供了大量的 “ 中間性產(chǎn)物 ” ，另一方面，菌體的能量水平得到提高。 前者是菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，后者則是菌體增殖的能量的保證。 這樣的結(jié)果是，有利于菌體的增殖和生長，則 GA的生物合成就會受到影響，甚至停止，這在生產(chǎn)上，就是通常我們說的 “ 只長菌，不產(chǎn)酸 ” 的現(xiàn)象。 108 ? 以上分析說明， GA發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期， 一定量 的生物素是菌體增殖所必需的 ；而 在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成 。