cr引物的設計與實驗操作技巧(編輯修改稿)
2025-02-02 16:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 AR HS Polymerase， ? ToYoBo公司的 Kod－ Plus Polymerase。 PCR產(chǎn)物的克隆 ? 在許多研究中 ,需要將 PCR產(chǎn)物克隆 ,以獲得目的 DNA片段。此時 ,所用 PCR循環(huán)數(shù)應盡量小 ,以減少平臺效應或非特異性擴增產(chǎn)物的干擾。通常將 PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法。 ? 1. 平末端連接 ：由于 Taq DNA聚合酶往往在 PCR產(chǎn)物 339。端加上多余的非模板依賴堿基 ,在用平末端連接克隆 PCR產(chǎn)物前 ,可用 Klenow片段或 T4 DNA聚合酶處理補平末端。 ? 2. 在 PCR產(chǎn)物克隆載體尾部加 dT或 ddT： Taq DNA聚合酶會在 339。端加上多余的非模板依賴堿基 ,而且對 A優(yōu)先聚合 ,所以 PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點 ,可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上 dT或 ddT,使載體與 PCR產(chǎn)物末端互補并進行連接 .載體末端加 dT尾可直接用 Taq DNA聚合酶和dTTP或 ddTTP,ddTTP因缺少 3OH而不能再形成磷酸二酯鍵 ,保證在載體 339。端只加上一個 ddTTP,而其 539。端所含的磷酸基團可與 PCR產(chǎn)物的 339。端 OH連接 ,連接產(chǎn)物在載體和 PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個切口 ,這種重組 DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌 ,并在細菌體內(nèi)修復 .目前很多公司已開發(fā)出可直接用于克隆 PCR產(chǎn)物的帶339。T的 TVector。 ? 3. 粘性末端連接 ：利用引物中附加在 539。端的限制酶位點 ,直接將 PCR產(chǎn)物經(jīng)適當?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端 ,與載體連接 ,產(chǎn)生重組 物中含有兩個不同的限制酶位點 .經(jīng)酶切后可定向克隆到載體中。 PCR反應有哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？ ? ① 模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量 ④ PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。 模板最容易出現(xiàn)的問題 ? 一、模板含有雜質(zhì)： ? ①模板中含有雜蛋白質(zhì)；②模板中含有 Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定 ,不宜隨意更改。 二、模板發(fā)生變異： ? 如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR擴增是不會成功的。 通常模板發(fā)生變異的主要原因是模板切膠回收時間過長（一般應控制在 1分鐘以內(nèi)）或無意中將模板置于超凈工作臺中滅菌所致。 PCR引物常見的問題 ? 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。 有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增 ，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看 OD值，更要 注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致 ，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做 PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。 ③ 引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏 ，導致引物變質(zhì)降解失效。④ 引物設計不合理 ，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 DNA聚合酶的問題 ? 酶失活 ：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。
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