cr引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧-預(yù)覽頁
【正文】 PCR的進(jìn)行需要確定三個(gè)溫度。第三，延伸溫度。 解鏈溫度的計(jì)算方法 ? 有幾個(gè)公式可用來計(jì)算寡核苷酸與其靶序列形成的雜合分子的熔解溫度。 Tm/?C=?C+(lg [k+])+%([G+C])(675/n)。 ? 現(xiàn)在已有一些軟件（如 Primer Premium 5）可精確計(jì)算所設(shè)計(jì)引物的 Tm值。 通常采用的退火溫度和時(shí)間為 48℃ 68℃,1 2min。 7．向引物的 5‘端添加限制性酶切位點(diǎn)，噬菌體啟動(dòng)子等序列 ? 有用而又不與靶 DNA序列互補(bǔ)的序列一般加到引物的 5’末端。因?yàn)槲挥?DNA分子 5‘末端的限制性酶切位點(diǎn)的切割效率比較低，所以引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少 3個(gè)核苷酸。 當(dāng)針對(duì) cDNA模板設(shè)計(jì)引物時(shí)，正向和反向引物最好結(jié)合到不同外顯子的不同區(qū)域。此時(shí) ,所用 PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小 ,以減少平臺(tái)效應(yīng)或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。 ? 2. 在 PCR產(chǎn)物克隆載體尾部加 dT或 ddT： Taq DNA聚合酶會(huì)在 339。端所含的磷酸基團(tuán)可與 PCR產(chǎn)物的 339。端的限制酶位點(diǎn) ,直接將 PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端 ,與載體連接 ,產(chǎn)生重組 物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn) .經(jīng)酶切后可定向克隆到載體中。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定 ,不宜隨意更改。 有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增 ，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。④ 引物設(shè)計(jì)不合理 ，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 ? 對(duì)于一些難以擴(kuò)增的模板，建議買 PCR Buffer中 Mg2+ free的 PCR試劑 ，以便自己通過一些預(yù)實(shí)驗(yàn)找出 PCR反應(yīng)中最佳的 Mg2+濃度。 另外， PCR管有普通管和薄壁管（ thin wall PCR tubes ）之分。 PCR出現(xiàn)假陽性的原因？ ? 假陽性： 出現(xiàn)的 PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致 ，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 （ 2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染： 這種污染有兩種原因： 一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因： 一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體 。 非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策（二） ? 采用熱啟動(dòng) PCR： ? 把 PCR混合物在顯著低于 Tm值的溫度下作哪怕短暫的保溫，也可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對(duì)。 ? 最近有一種熱啟動(dòng)的方法是在加入 Taq DNA聚合酶前先在管中加入其單克隆抗體 （ Cloech 公司的 Taq Start Antibody，或者 ToYoBo公司的 Kod Plus DNA聚合酶 ）， 在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻遏聚合酶的活性，防止反應(yīng)開始。這種辦法即使在目的產(chǎn)物開始用 EB染色檢測(cè)不到而且有假象帶時(shí)也常常獲得成功。 嵌套式 PCR極端敏感，在 106基因組 DNA背景中一個(gè)拷貝的病毒基因也能檢測(cè)到。 進(jìn)行多輪 PCR時(shí)， PCR產(chǎn)物 成片的原因 ? ? 進(jìn)行多輪 PCR時(shí)，如果下一輪 PCR反應(yīng)的起始模板量太大，即使 PCR條件是正常的，產(chǎn)物成片現(xiàn)象也可能會(huì)出現(xiàn)。這一可選步驟的標(biāo)準(zhǔn)條件是 95?C變性 5分鐘， 有可能擴(kuò)增發(fā)生了，只是效率不高，如果這樣，可通過對(duì)干凝膠或印跡的雜交來檢測(cè)產(chǎn)物。通過把原 PCR混合物與已知陽性對(duì)照模板（被證明可以擴(kuò)增）的稀釋物混合的方法可以驗(yàn)證制備的模板中是否
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1