cr引物的設計與實驗操作技巧-全文預覽
【正文】 僅要看 OD值，更要 注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致 ，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做 PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。 二、模板發(fā)生變異： ? 如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR擴增是不會成功的。 PCR反應有哪些關鍵環(huán)節(jié)？ ? ① 模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量 ④ PCR循環(huán)條件。端 OH連接 ,連接產物在載體和 PCR產物之間的雙鏈上帶兩個切口 ,這種重組 DNA仍可轉化合適的受體菌 ,并在細菌體內修復 .目前很多公司已開發(fā)出可直接用于克隆 PCR產物的帶339。端加上多余的非模板依賴堿基 ,而且對 A優(yōu)先聚合 ,所以 PCR產物末端的多余堿基大部分都是A.。通常將 PCR產物插入到載體中有下列一些方法。 這些可以很容易地把來源于 cDNA的擴增產物和來源于污染的基因組 DNA的擴增產物區(qū)分開。 保護堿基的確定 ? 保護堿基的確定不是隨意的，通常每一種限制性內切酶都有自己最佳的保護堿基。 一般來說，這些序列的存在不會顯著地影響寡核苷酸和靶 DNA之間的復性。 6. 3‘末端 3’末端的性質非常關鍵。 ? 退火溫度越高 , 所得產物的特異性越高。 該公式能夠合理預測一條長度為 14－ 70個核苷酸的引物 在小于或等于 子溶液中的熔解溫度。但沒有一個是盡善盡美的。 對 Taq DNA聚合酶來說最適溫度一般為 72?C－ 78?C。 第一，變性溫度 ，變性往往是在 94?C－ 95?C進行，這是 Taq DNA聚合酶進行 30個或 30個以上 PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時所耐受的最高溫度； 第二，退火溫度。 計算出來的兩個引物的 Tm值相差不能大于 5 ?C。如果引物二聚體在 PCR早期形成，它將和 DNA聚合酶、引物及核苷酸競爭進而抑制靶 DNA的擴增。 3. 重復和自身互補序列 ? 不能有大于 3bp的重復序列或自身互補序列存在。另外長引物在合成的時候出錯率也顯著增加。 PCR引物設計的幾條原則： ? ① 引物長度 ? 一般引物長度為 1830堿基就足夠了。 ? 模板 DNA。 ? 二價陽離子。而三者中，PCR方法在理論上出現最早，在實踐中應用得最廣泛。 一、 PCR引物的設計與實驗操作技巧 ? 聚合酶鏈式反應、分子克隆及 DNA序列分析這三大類實驗方法幾乎構成了現代分子生物學的實驗工作的基礎。 ? dNTP（混合液：標準 PCR反應包含 4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即 dATP、 dTTP、 dCTP和 dGTP。標準 PCR緩沖液內包含有 50 mmol/L的 KCl，它對于擴增大于 500 bp的 DNA片段是有益的，提高 KCl濃度在約 70－100mmol/L范圍內對改善擴增較短的 DNA片段產物是有利的。盡管模板 DNA的長短不是 PCR擴增的關鍵因素，但當使用高分子量的 DNA（ 10kb）作模板時，如用限制性內切酶先行消化（此酶不應切割其中的靶序列），則擴增效果更好。原因一是超過 60bp長度的引物比較難以合成，因此合成價格大幅度增加。若是引物存在嚴重的GC傾向或 AT傾向則 可以在引物 5’端加適量的A、 T或 G、 C尾巴。 因為在 PCR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補，都會導致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴增。 5. 解鏈溫度（ Tm） ? 解鏈溫度（ Tm）： 也稱熔化溫度。 為什么要計算引物的解鏈溫度 ? 因為
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